تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات
Summary
The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.
Abstract
Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.
Introduction
البريونات هي الأمراض العصبية الشديدة التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. أمراض البريون تنتج من misfolding من بروتين بريون الخلوي العادي، بي ار بي سي، من خلال آيزومور المعدية يسمى بي ار بي الدقة. هذه الأمراض تؤثر على مجموعة واسعة من الأنواع بما في ذلك مرض جنون البقر في بقرة، سكرابي في الأغنام ومرض الهزال المزمن في cervids، ومرض كروتزفيلد جاكوب في البشر 1-3. البريونات تسبب التنكس العصبي الذي يبدأ مع فقدان متشابك، ويتقدم لتشكل الفجوات، دباق، وفقدان الخلايا العصبية، والترسبات. في نهاية المطاف، مما أدى إلى موت الحيوان / الفردي 4. على مدى عقود، وقد حقق باحثو تهدف إلى إبطاء أو وقف تطور مرض بريون. ومع ذلك، لم يتم العثور على الباحثين إما العلاج الناجح أو وسيلة فعالة لتوصيل النظامية.
مطلوب الذاتية التعبير بي ار بي سي لتطور أمراض البريون 5 </sتصل>. لذلك، قد يؤدي خفض أو القضاء على بي ار بي C التعبير في تأخير أو تحسين من المرض. خلقت عدة مجموعات الفئران المعدلة وراثيا مع انخفاض مستويات بي ار بي C أو lentivectors حقن معربا عن shRNA مباشرة إلى أنسجة المخ الفئران للتحقيق في دور مستويات التعبير بي ار بي سي في مرض بريون. أدت هذه وجد الباحثون تقليل كمية الخلايا العصبية بي ار بي سي في وقف الأعصاب التدريجي للأمراض البريون وتمديد حياة الحيوانات 6-9. لقد ذكرت أن نتائج العلاج بي ار بي سي سيرنا في تطهير بي ار بي الدقة في الخلايا العصبية الماوس 10. وتشير هذه الدراسات إلى أن استخدام العلاج لخفض مستويات التعبير بي ار بي سي، مثل صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا)، الذي يشق مرنا، قد يؤخر بما فيه الكفاية تطور أمراض البريون. ومع ذلك، تم تسليم معظم العلاجات التحقيق لأمراض البريون بطرق لن يكون عمليافي عملية إعداد سريرية. ولذلك، فإن العلاج سيرنا يحتاج إلى نظام تسليم النظامية، والتي يتم تسليمها عن طريق الوريد وهادفة إلى الجهاز العصبي المركزي.
وقد درس الباحثون استخدام الجسيمات الشحمية بوصفها وسائل إيصال للمنتجات العلاج الجيني. كلاهما يستخدم الدهون الموجبة والأيونية في تشكيل الجسيمات الشحمية. وتستخدم الدهون الموجبة أكثر على نطاق واسع من الدهون أنيوني لأن الفرق تهمة بين الدهون الموجبة وDNA / RNA يسمح للتعبئة فعالة. ميزة أخرى من الدهون الموجبة هي أنها عبور غشاء الخلية بسهولة أكثر من الدهون الأخرى 11-14. ومع ذلك، والدهون الموجبة أكثر مناعة من الدهون أنيوني 13،14. ولذلك، فقد بدأ الباحثون في التحول من استخدام الموجبة لأنيونية الدهون في الجسيمات الشحمية. منتجات العلاج الجيني يمكن تعبئتها بكفاءة في الجسيمات الشحمية الأيونية باستخدام موجبة كبريتات الببتيد بروتامين، التي يتكثف جزيئات DNA / RNA 15-19. منذ معهد العلوم الإندونيسي انيونيس أقل مناعة من الدهون الموجبة أنها قد زادت مرات الدورة الدموية، ويمكن أكثر التسامح في النماذج الحيوانية 13،14. وتستهدف الجسيمات الشحمية لأنسجة معينة باستخدام استهداف الببتيدات التي تعلق على الجسيمات الشحمية. ونيوروبيبتيدي RVG-9R التي تربط لمستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية وقد استخدمت لاستهداف سيرنا والجسيمات الشحمية إلى الجهاز العصبي المركزي 17-20.
ويعرض هذا التقرير على بروتوكول لإنتاج ثلاث عربات تسليم سيرنا، وحزم وتسليم سيرنا إلى الخلايا العصبية (الشكل 1). وتتكون المجمعات الحويصلية سيرنا الببتيد (LSPCs) من الجسيمات الشحمية مع سيرنا وRVG-9R استهداف الببتيد تعلق كهربية إلى السطح الخارجي للالحويصلية. تناول الببتيد الحويصلية مغلفة العلاجية سيرنا (PALETS) وتتكون من سيرنا وبروتامين مغلفة ضمن الجسيمات الشحمية، مع RVG 9R المستعبدين تساهميا إلى مجموعة الدهون PEG. باستخدام الأساليب التالية لتوليد LSPCs وPALETS، بي ار بي سي سيرنا يقلل بي ار بي C التعبير تصل إلى 90٪ في الخلايا العصبية، التي يحمله من آمال عريضة لعلاج أو إلى حد كبير تأخير ظهور الأمراض مرض بريون.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا التقرير بروتوكول لإنشاء نظامين تسليم المستهدفة التي تنقل بكفاءة سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي. وتضمنت الأساليب السابقة من تقديم سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن ناقلات سيرنا / shRNA مباشرة في الدماغ، والحقن في الوريد من سيرنا المستهدفة، أو الح?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.
Materials
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2um filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40um Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary – PRC |
Referências
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of ‘intelligent’ liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
