משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים
Summary
The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.
Abstract
Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.
Introduction
פריונים הן מחלות ניווניות קשות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מחלות פריון לנבוע misfolding של חלבון הפריון הסלולרי הרגיל, PRP C, על ידי האיזומר זיהומיות בשם PRP מיל. מחלות אלו משפיעים מגוון רחב של מינים, כולל ספגת המוח בפרות, scrapie בכבשים, חולה במחלה ממארת כרונית cervids, ואת מחלת קרויצפלד-יעקב בבני אדם 1-3. פריונים לגרום ניוון מוחיה שמתחיל עם אובדן הסינפטי, ומתקדם כדי vacuolization, דבק, איבוד עצבי, ופיקדונות פלאק. בסופו של דבר, מה שגרם למותם של בעלי החיים / 4 פרט. במשך עשרות שנים, חוקרים חקרו תרכובות אמורות להאט או לעצור את התקדמות מחלת פריון. עם זאת, חוקרים לא מצאו או טיפול מוצלח או רכב משלוח מערכתי אפקטיבי.
ביטוי PRP C אנדוגני נדרש לפיתוח מחלות הפריון 5 </sעד>. לכן, הפחתה או ביטול ביטוי PRP C עלול לגרום עיכוב או שיפור של מחלה. מספר קבוצות יצרו עכברים טרנסגניים עם רמות נמוכות של PRP C או lentivectors מוזרק המבטא shRNA ישירות לתוך רקמת המוח בעכברים לחקור את התפקיד של רמות הביטוי PRP C במחלת הפריון. חוקרים אלה מצאו הפחתת כמות העצבית PRP C הביא לעצירת בנוירופתולוגיה מתקדמת של מחלות הפריון והאריך את החיים של בעלי החיים 6-9. אנחנו דיווחנו על תוצאות טיפול PRP C siRNA בסילוק של PRP מיל בתאי נוירובלסטומה עכבר 10. מחקרים אלה מראים כי השימוש של טיפולים כדי להפחית את רמות ביטוי PRP C, כמו RNA התערבות הקטן (siRNA), אשר מסלק mRNA, אולי מספיק לעכב את התקדמות מחלות פריון. עם זאת, רוב הטיפולים נחקר למחלות הפריון נמסרו בדרכים לא יהיה מעשיבמסגרת רפואית. לכן, טיפול siRNA צריך מערכת משלוח מערכתית, אשר מועברת דרך וריד וממוקד אל מערכת העצבים המרכזי.
החוקרים חקרו את השימוש ליפוזומים כרכב משלוח למוצרי ריפוי גנטי. שומני קטיוני anionic הוא משמשים ההיווצרות של ליפוזומים. שומני קטיוני משמשים באופן נרחב יותר מאשר שומני anionic כי הבדל התשלום בין שומני קטיוני ה- DNA / RNA מאפשר אריזה יעילה. יתרון נוסף של שומני קטיוני הוא שהם לחצות את קרום התא בקלות רבה יותר מאשר שומנים אחרים 11-14. עם זאת, שומנים קטיוני יותר immunogenic מאשר שומנים anionic 13,14. לכן, החוקרים החלו המעבר משימוש קטיוני כדי anionic שומנים ליפוזומים. ג'ין מוצרי טיפול ניתן לארוז ביעילות לתוך ליפוזומים anionic באמצעות סולפט protamine פפטיד בעלי מטען חשמלי חיובי, אשר מתעבה מולקולות DNA / RNA 15-19. מאז lipi anionicds פחות immunogenic מאשר שומנים קטיוני הם עשויים גדלו פעמים במחזור, ועלול להיות נסבל יותר במודלים של בעלי חיים 13,14. ליפוזומים ממוקדים רקמות ספציפיות באמצעות מיקוד פפטידים מחוברים אל ליפוזומים. ונוירופפטידים RVG-9R, אשר נקשר לקולטנים אצטילכולין ניקוטינית, נעשה שימוש כדי למקד siRNA ו ליפוזומים אל CNS 17-20.
דו"ח זה מתאר פרוטוקול לייצר שלושה כלי רכב משלוח siRNA, וכדי לארוז ולספק את siRNA לתאי נוירונים (איור 1). Liposome-siRNA-פפטיד מתחמי (LSPCs) מורכבים ליפוזומים עם siRNA ואת RVG-9R מיקוד פפטיד אלקטרוסטטי מחובר אל פני השטח החיצוני של liposome. פפטיד התייחס ליפוזום כמוס siRNA (PALETS) טיפוליות מורכבות siRNA ו protamine כמוס בתוך liposome, עם ערובה RVG-9R קוולנטית לקבוצות PEG השומנים. באמצעות השיטות הבאות כדי ליצור LSPCs ו PaletS, PRP C siRNA פוחתת ביטוי PRP C עד 90% ב תאים עצביים, אשר טומן בחובו הבטחה עצומה לרפא או מהותית לעכב את התחלתה של פתולוגיה מחלת הפריון.
Protocol
Representative Results
Discussion
דו"ח זה מתאר פרוטוקול ליצור שתי מערכות אספקת ממוקדות שמעבירה siRNA ביעילות אל מערכת העצבים המרכזית. שיטות קודמות של אספקת siRNA אל מערכת העצבים המרכזיים כללו הזרקת וקטורי siRNA / shRNA ישירות לתוך המוח, הזרקה תוך ורידית של siRNA הממוקד, או הזרקה תוך ורידית של מתחמים ליפוזום-siRNA ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.
Materials
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2um filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40um Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary – PRC |
Referências
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of ‘intelligent’ liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
