Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas
Summary
The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.
Abstract
Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.
Introduction
Os priões são graves doenças neurodegenerativas que afectam o SNC. Doenças de priões, resultar a partir do enrolamento incorrecto da proteína prião celular normal, a PrP C, por um chamado isómero infecciosa PrP Res. Estas doenças afectam uma grande variedade de espécies, incluindo a encefalopatia espongiforme bovina em vacas, scrapie em ovinos, a doença emaciante crónica dos cervídeos, ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos 1-3. Prions causar neurodegeneração que começa com a perda sináptica, e progride para vacuolização, gliose, perda neuronal, e depósitos de placas. Eventualmente, resultando na morte do animal / indivíduo 4. Durante décadas, os pesquisadores investigaram compostos destinados a retardar ou parar a progressão da doença de príon. No entanto, os investigadores não encontraram qualquer uma terapia bem sucedida ou um veículo eficaz de entrega sistémica.
Endógena expressão da PrP C é necessária para o desenvolvimento de doenças provocadas por priões 5 </s-se>. Por isso, diminuindo ou eliminando a expressão da PrP C pode resultar num atraso ou melhoria da doença. Vários grupos de ratinhos transgénicos criados com níveis reduzidos de PrP C ou lentivectores injectados expressam shRNA directamente no tecido cerebral de murino para investigar o papel dos níveis de expressão da PrP C em doenças de prião. Estes investigadores encontraram reduzindo a quantidade de PrP C neuronal resultaram em travar a neuropatologia progressiva de doenças provocadas por priões e estendeu a vida dos animais 6-9. Nós relataram que os resultados do tratamento PrP C siRNA na depuração da PrP Res em células de rato neuroblastoma 10. Estes estudos sugerem que o uso de terapias para diminuir os níveis de expressão da PrP C, como pequeno ARN interferente (siRNA), que cliva o ARNm, podem suficientemente retardar a progressão de doenças provocadas por priões. No entanto, a maioria das terapias investigados para doenças de prião foram entregues de formas que não seria práticoem um ambiente clínico. Portanto, uma terapia de ARNsi necessita de um sistema de entrega sistémica, que é entregue por via intravenosa e orientada para o SNC.
Os investigadores estudaram a utilização de lipossomas como veículos de entrega de produtos de terapia génica. Os lípidos catiónicos e aniónicos são ambos usados na formação dos lipossomas. Os lípidos catiónicos são mais amplamente utilizados de lípidos aniónicos, porque a diferença de carga entre o lípido catiónico e do ADN / ARN permite o empacotamento eficiente. Outra vantagem de lípidos catiónicos é que eles atravessam a membrana celular mais facilmente do que outros lípidos 11-14. No entanto, os lípidos catiónicos são mais imunogénicos do que os lípidos aniónicos 13,14. Portanto, os pesquisadores começaram a mudar de usar catiônico para ani�icos lípidos em lipossomas. Produtos de terapia génica pode ser eficazmente embalado em lipossomas aniónicos, utilizando o sulfato de protamina péptido carregado positivamente, que se condensa moléculas de ADN / ARN 15-19. Desde Lipi aniônicaDS são menos imunogénicos do que os lípidos catiónicos podem ter tempos de circulação aumentados, e podem ser mais tolerados em modelos animais 13,14. Os lipossomas são direcionados para os tecidos específicos usando segmentação peptídeos que estão ligados aos lipossomas. O neuropeptídeo RVG-9R, que se liga a receptores nicotínicos da acetilcolina, tem sido utilizado para segmentar siRNA e lipossomas para o SNC 17-20.
Este relatório descreve um protocolo para produzir três veículos de entrega de siRNA, e para empacotar e entregar o siRNA para as células neuronais (Figura 1). complexos de siRNA-lipossoma-péptido (LSPCs) são compostos de lipossomas com o siRNA e RVG-9R peptídeo alvo electrostaticamente ligado à superfície exterior do lipossoma. Péptido dirigida lipossoma encapsulado terapêuticos siRNA (PALETS) são compostos de siRNA e protamina encapsulado no interior do lipossoma, com RVG-9R covalentemente ligado a grupos de PEG lípido. Usando os métodos abaixo para gerar LSPCs e PALETS, PrP C siARN diminui a expressão da PrP C até 90% em células neuronais, o que possui tremendo potencial para curar ou retardar o aparecimento da patologia da doença do prião substancialmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório descreve um protocolo para criar dois sistemas de administração específicas que transporta de forma eficiente siRNA para o SNC. Os métodos anteriores de entrega de siRNA para o SNC incluíram injecção de vectores de ARNsi / shRNA directamente para o cérebro, a injecção intravenosa de siRNA alvo, ou injecção intravenosa de complexos lipossoma-siRNA não-alvo. A injecção de vectores de ARNsi / shRNA no SNC não causar uma diminuição nos níveis de expressão da proteína alvo. No entanto, o …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.
Materials
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2um filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40um Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary – PRC |
Referências
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