Murine छोटे आंतों लिम्फोसाइटों के अलगाव और प्रवाह cytometric विशेषता
Summary
There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.
Abstract
आंतों – जो शरीर में किसी भी अंग की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या सबसे अधिक होते हैं – लगातार विदेशी एंटीजन, दोनों माइक्रोबियल और आहार के संपर्क में हैं। एक बढ़ती हुई समझ है कि इन ल्यूमिनल एंटीजन मदद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की है कि शिक्षा के आकार के भीतर आंत प्रणालीगत रोगों के एक नंबर के लिए महत्वपूर्ण है को देखते हुए, वहाँ आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली निस्र्पक में दिलचस्पी बढ़ा दी गई है। हालांकि, कई प्रकाशित प्रोटोकॉल कठिन और समय लेने वाली हैं। हम यहाँ छोटे आंत्र लामिना propria, अंतःउपकला परत, और Peyer पैच कि, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और श्रमसाध्य Percoll ढ़ाल की आवश्यकता नहीं है से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे। हालांकि प्रोटोकॉल छोटी आंत पर केंद्रित है, यह भी पेट के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, हम कुछ पहलुओं है कि विशिष्ट वैज्ञानिक सवाल के आधार पर अतिरिक्त अनुकूलन की जरूरत हो सकती है पर प्रकाश डालाtion। यह दृष्टिकोण व्यवहार्य लिम्फोसाइट की बड़ी संख्या है कि बाद में प्रवाह cytometric विश्लेषण या लक्षण वर्णन के वैकल्पिक साधन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का अलगाव में यह परिणाम है।
Introduction
छोटी आंत का मुख्य कार्य अक्सर पाचन और पोषक तत्वों के अवशोषण 1 माना जाता है। इस चयापचय समारोह स्पष्ट रूप से आवश्यक है, छोटी आंत पर्यावरण एंटीजन लुमेन 2 के भीतर पाया की नित्य बैराज से मेजबान की रक्षा करने में एक समान रूप से महत्वपूर्ण भूमिका है। आंत्र पथ बाहर की दुनिया को अलग करती है (जैसे।, ल्यूमिनल एंटीजन) एक उपकला परत है कि केवल एक ही सेल परत मोटी के साथ मेजबान के आंतरिक वातावरण से। जैसे, छोटे-आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली जेट के लिए अपनी सीमा यदि कोई हो, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संतुलन, कम से कम के साथ म्यूकोसा में प्रवेश के लिए आहार और खानेवाला रोगाणुओं से विदेशी एंटीजन की इजाजत दी, जबकि हमलावर रोगज़नक़ों और के खिलाफ एक मजबूत प्रतिक्रिया बढ़ते दुर्जेय काम है अन्य "हानिकारक" एंटीजन। इन एंटीजन को अत्यधिक या अनुचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (वैकृत रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जैसे।, Inflammaइतिहास आंत्र रोग, मधुमेह प्रकार मैं, एकाधिक काठिन्य) और 3-6 से परहेज किया जाना चाहिए।
कुल मिलाकर, जठरांत्र पथ शरीर में सबसे बड़ा प्रतिरक्षा अंग का प्रतिनिधित्व करने के लिए, सभी प्रतिरक्षी कोशिकाओं स्रावित 7 के 70% से युक्त माना जाता है। लामिना propria (एलपी), अंतःउपकला परत, और Peyer पैच (पीपीएस) – – छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली 3 मुख्य डिब्बों के शामिल है कि प्रत्येक लिम्फोसाइट 2 के एक विशिष्ट समूह में शामिल है। एल.पी. लिम्फोसाइटों (LPLs) मुख्य रूप से ~ 20% बी कोशिकाओं के साथ TCRαβ + टी कोशिकाओं रहे हैं; अंतःउपकला लिम्फोसाइटों (IELs) TCRαβ + टी कोशिकाओं की तुलना में अधिक TCRγδ + टी कोशिकाओं के साथ बहुत कुछ बी कोशिकाओं होते हैं; और पी पी एस, जो माध्यमिक लसीकावत् छोटे-आंतों की दीवारों में एम्बेडेड अंग हैं, ~ 80% बी कोशिकाओं होते हैं। हालांकि इन संरचनात्मक क्षेत्रों में से प्रत्येक से थोड़ा अलग कार्यों और सात्विक कुर्सियां है, वे में कार्य आहarmonized फैशन रोगजनक अपमान से मेजबान की रक्षा के लिए।
इसके अलावा, वहाँ बढ़ रही सराहना की है कि माइक्रोबायोटा आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक, विशिष्ट रोगाणुओं और विशेष सेल प्रजातियों 8,9 के ontogeny के बीच आत्मीय रिश्ते की मान्यता में वृद्धि के साथ है। इसके अलावा, यह देखते हुए कि आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली की शिक्षा anatomically दूर साइटों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है (जैसे।, गठिया, एकाधिक काठिन्य, निमोनिया), यह स्पष्ट हो गया है कि आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के लिए और अधिक रोग प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक की तुलना में पहले 10 में मान्यता प्राप्त है -12। जैसे, मात्रात्मक आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली का आकलन करने में दिलचस्पी अब मेजबान खानेवाला बातचीत और कई प्रणालीगत रोगों के रोगजनन को भी शामिल करने के लिए मेजबान रोगज़नक़ बातचीत से आगे बढ़ाया गया है।
में मौजूदा तरीकों की परिवर्तनशीलता को देखते हुएआंतों लिम्फोसाइटों के अलगाव, एक विधि है, जबकि समय की आवश्यकता संतुलन तेजी से महत्वपूर्ण है कि उपज, व्यवहार्यता, और स्थिरता के लिए अनुकूलित है। प्रोटोकॉल है कि Percoll ढ़ाल शामिल है, समय और श्रम गहन और संभवतः अधिक मानव त्रुटि से ग्रस्त हैं चर उपज के लिए अग्रणी और 13 व्यवहार्यता। इस के साथ साथ, हम सब 3 छोटे-आंतों प्रतिरक्षा डिब्बों से अलगाव और लिम्फोसाइटों के लक्षण वर्णन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रणाली में सूक्ष्म जीव प्रेरित परिवर्तन में दी बढ़ती रुचि है, हम कदम है कि चूहों के बीच सूक्ष्म जीवाणुओं की क्षैतिज संचरण का आकलन करने के लिए कैसे इन परिवर्तनों मात्रात्मक आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावित करने के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत और प्रवाह LPLs, IELs, और पी पी एस में लिम्फोसाइट सहित छोटे आंत्र लिम्फोसाइटों के cytometric विशेषता। का मूल्यांकन कैसे माइक्रोबायोटा में परिवर्तन छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रण?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NKS is supported by NIH award K08 AI108690.
Materials
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| stir bar | VWR | 58949-062 | |
| multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 96-well plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (optional) fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
Referências
- Cummings, D. E., Overduin, J. Gastrointestinal regulation of food intake. J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
