HPLC-基于化验，以监测外核苷酸/核苷代谢的人类慢性淋巴细胞白血病细胞
Summary
The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.
Abstract
该方法描述了一种敏感，特异的，可靠的和可重现的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定法开发并验证胞外嘌呤核苷酸和核苷通过纯化的慢性淋巴细胞性白血病产生（CLL）细胞的不同培养条件下的量化。腺苷5'-一磷酸的（AMP），腺苷（ADO）的色谱分离和肌苷（INO）在RT上被用于极性化合物的保留的基于二氧化硅的，反相柱进行。该方法包括一个二元流动相，它由7 mM醋酸铵和乙腈为1.00毫升/分钟的流速。洗脱液使用一光电二极管阵列UV检测器设定在260nm监测。标准校正曲线生成以计算方程式为每个嘌呤化合物的分析定量。系统控制，数据采集和分析，然后进行。运用这一协议，AMP，INO和ADO分别洗脱在7,11和11.9分钟，和总运行时间为每个样品20分钟。该协议可以使用培养基作为基质施加到不同类型的细胞和细胞系（包括悬浮液和粘附）。的优点是容易和快速的样品制备和分析少量上清液的要求。此外，使用无血清培养基中允许跳过用乙腈沉淀蛋白的步骤，影响嘌呤化合物的最终浓度。一种该方法的局限性是每个单个样品运行之前运行平衡柱的要求，使得在实验的总运行时间更长，并防止高通量筛选应用。
Introduction
腺苷（ADO）是嘌呤核苷通过糖苷键连接于核糖分子部分连接的腺嘌呤分子。当存在于细胞外的环境中，它由免疫系统的作用可以防止过度的损伤的细胞。这种作用已用不同的疾病模型，如结肠炎1，糖尿病2，哮喘3，败血症4，和局部缺血性损伤的5突出。其中一个主要的ADO功能是在肿瘤微环境的免疫应答的抑制，促进肿瘤免疫逃避6。出于这个原因，参与ADO形成和信令的机制相当的治疗利益7。
在组织微环境的ADO水平正常生理条件下，当然低于免疫细胞的灵敏度阈值相对较低。然而，缺氧时，局部缺血，炎症，感染，代谢压力和肿瘤转型，他们迅速增加8。响应于组织扰动信号升高胞外ADO水平具有双重功能：报告组织损伤以自分泌和旁分泌方式并产生可通常被视为细胞保护组织反应。
胞ADO可以通过多种机制，包括从由因为通过腺苷脱氨酶操作受损降解的核苷转运9或积累介导的细胞内区室释放而形成。导致增加的胞外ADO水平的主要途径包括ectonucleotidases，这是膜相关ectoenzymes通过从死亡或垂死细胞释放的核苷酸phosphohydrolysis产生的ADO级联的作用。该途径通过CD39的顺序动作前进（ectonucleoside三磷酸diphosphohydrolase-1），该转换外腺苷5'-三磷酸（ATP）或腺苷5'-二磷酸（ADP）腺苷5'-一磷酸（AMP）和CD73（5'-核苷酸）的，它转换AMP到ADO 10。
胞ADO通过结合到4个跨膜ADO受体，即A 1，A 2A，A 2B和A 3引出其生理反应。每个受体有ADO和特定的组织分布不同的亲和力。所有的受体具有七次跨膜域和是G-蛋白偶联于细胞内的GTP结合蛋白（G蛋白），即可以诱导（G蛋白）或抑制（Gi蛋白）腺苷酸环化酶活性，并随后在生产细胞内cAMP。因此，在过程中的生理反应11上的细胞内的蛋白激酶活性的胞质cAMP水平的影响的变化。在生理条件下细胞外ADO是低于1微米，它可以激活不加区别A 1，A 2A和A 3受体。然而，A2B亚型的激活需要相当高的核苷的浓度，如病理生理条件下产生的。可替代地，细胞外ADO可以被降解为肌苷（INO）腺苷脱氨酶（ADA）和CD26，一个ADA络合蛋白在细胞表面上定位ADA。另一种可能性是，ADO是由细胞通过平衡型核苷转运（ENT）和磷酸化，以AMP通过ADO激酶蛋白12,13内化。
该协议的目的是描述反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的分析方法在单次运行来量化基板AMP和产品ADO和INO，由人淋巴细胞作为生成的。最初使用来自慢性淋巴细胞白血病（CLL）的患者，其特征为CD19 + / CD5 + B淋巴细胞组成型表达CD39 14,15的成熟群体的膨胀细胞得到我们的经验。我们大约30表现％CLL患者表达CD73胞外酶，而这表型预后不良相关16。白血病细胞共表达CD39和CD73的这种亚群可以积极借鉴ADP和/或AMP产生胞ADO。 CD73 + CLL细胞用α预孵育，β亚甲基ADP（APCP），CD73酶活性的已知抑制剂，完全阻断细胞外的ADO合成确认CD73表示级联16的瓶颈酶。
CLL细胞还表达ADA和ADA的络合蛋白CD26，这是负责ADO转化成INO。通过使用特定的ADA抑制剂，如赤-9-（2-羟基-3-壬基）我wiadenine（EHNA）盐酸盐和deoxycoformycin（DCF），它可以阻止细胞外ADO降解成INO。此外，预处理与潘生丁联合ADA抑制剂，阻止核苷转运，增强细胞积累ADO上清。
然后，我们扩展了这个协议从其他谱系，包括T淋巴细胞和骨髓细胞，证实CD73依赖ADO生产的细胞。这些结果表明，此HPLC协议是高度通用的，并且它可以被应用到不同的细胞谱系和对不同的培养条件下（ 图1）。
负责细胞外ADO生产酶促机械的 图1 示意图。腺苷5'-三磷酸（ATP）和/或腺苷5'-二磷酸（ADP）可通过CD39降解为腺苷5'-一磷酸（AMP），其中又通过CD73转化成核苷腺苷（ADO）。一旦ADO技术是在细胞外空间中产生，它可以重新进入通过核苷转运（ENT）细胞中，被转化成肌苷（INO）或绑定到不同类型的P1 ADO受体。 请点击此处查看该图的放大版本。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里所描述的协议允许评价在细胞培养介质中的CD39 / CD73 adenosinergic机械从纯化的人白血病细胞的活性。通过这样的高效液相色谱法，我们可以遵循和定量测定酶生成ADO（CD73依赖型）和其随后的降解INO（CD26 / ADA相关）的。使用酶抑制剂的允许控制协议，并有内部控制。这个协议的优点和新奇是i）其可以施加到在培养生长的细胞，即ⅱ）它需要培养基少量且iii）所述的样品制备是非常容易的。
<…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由意大利ASSOCIAZIONE Ricerca巨蟹座（IG＃12754）的支持。
Materials
| Human blood | |||
| Milli-Q water | Millipore | double deionised water | |
| Ficoll-Paque Plus | GE-Healthcare | 17-1440-03 | |
| purified anti-CD3, -CD14, -CD16 | made in-house | mouse monoclonal | |
| PE-labeled anti-CD19 | Miltenyi Biotec | 120-014-229 | |
| FITC-labeled anti-CD5 | Miltenyi Biotec | 130-096-574 | |
| Dynabeads sheep anti-mouse IgG | Invitrogen | 11031 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Amresco | E404-200TABS | tablets |
| bovine serum albumin (BSA) | ID bio | 1000-70 | standard grade |
| isolation buffer | PBS 0.1 % BSA 2 mM EDTA, pH 7.4 | ||
| AIM V serum free medium | GIBCO | 12055-091 | liquid (research grade) |
| adenosine 5’-diphosphate (ADP) | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| adenosine 5’-monosphate (AMP) | Sigma-Aldrich | A1752 | |
| adenosine (ADO) | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| inosine (INO) | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| α,β-methylene-ADP (APCP) | Sigma-Aldrich | M8386 | CD73 inhibitor |
| EHNA hydrochloride | Sigma-Aldrich | E114 | adenosine deaminase inhibitor |
| Deoxycoformycin (dCF) | Tocris | 2033 | adenosine deaminase inhibitor |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dipyridamole | Sigma-Aldrich | D9766 | nucleoside transporter inhibitor |
| acetonitrile (CHROMASOLV Plus) | Sigma-Aldrich | 34998 | HPLC-grade |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 9688 | 7 mM, pH 3.0 |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721-1L | min. 37 % |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bürker cell counter | VWR | 631-0920 | hemocytometer |
| DynaMag-15 Magnet | Invitrogen | 12301D | Dynal magnetic bead separator |
| microcentrifuge safe-lock tubes | Eppendorf | 030-120-0086 | 1.5 ml |
| PET centrifuge tubes | Corning | 430053/430304 | 15 – 50 ml |
| Minisart RC4 syringe filters | Sartorius Stedim Biotech | 17821 | membrane 0.2 µm |
| short thread vials | VWR | 548-0029 | 1.5 ml/glass |
| micro-inserts | VWR | 548-0006 | 0.1 ml/glass |
| screw caps | VWR | 548-0085 | 9 mm/PP blue |
| Atlantis dC18 Column | Waters | 186001344 | 5 µm, 4.6 x 150 mm |
| Atlantis dC18 Guard Column | Waters | 186001323 | 5 µm, 4.6 x 20 mm |
| Waters Alliance 2965 Separations Module | Waters | HPLC separation module | |
| Waters 2998 Photodiode Array (PDA) Detector | Waters | UV detector | |
| Waters Empower2 software | Waters |
Referências
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