Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Sandip Basak; Soumili Chatterjee; Sudha Chakrapani

doi:10.3791/54127

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Artigo de método

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

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DOI:

10.3791/54127

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4 de julho de 2016

Sandip Basak¹ , Soumili Chatterjee¹ , Sudha Chakrapani¹^,²

¹Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, ²School of Medicine, Case Western Reserve University

Autores correspondentes: Sudha Chakrapani <sxc584@case.edu>

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve métodos para marcação de spin dirigida ao local e reconstituição de canais controlados por ligantes pentaméricas para estudos de ressonância paramagnética eletrônica. Este protocolo pode ser adaptado para qualquer proteína de membrana. O método de reconstituição descrito aqui também pode ser usado para medições de patch clamp de correntes macroscópicas e de canal único em um sistema lipídico definido.

Resumo

O canal iônico é uma orquestração orientada por estímulos de movimentos de proteínas que leva a transições entre estados fechados, abertos e dessensibilizados. Fundamental para essas transições é a flexibilidade intrínseca da proteína, que é criticamente modulada pela composição lipídica da membrana. Para entender melhor a base estrutural da função do canal, é necessário estudar a dinâmica das proteínas em um ambiente de membrana fisiológica. A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) é uma ferramenta importante para caracterizar transições conformacionais entre estados funcionais. Em comparação com a RMN e a cristalografia de raios-X, as informações obtidas da EPR são intrinsecamente de menor resolução. No entanto, ao contrário de outras técnicas, no EPR não há limite superior para o peso molecular da proteína, os requisitos da amostra são significativamente menores e, mais importante, a proteína não é restringida pelas forças da rede cristalina. Portanto, o EPR é exclusivamente adequado para estudar grandes complexos de proteínas e proteínas em sistemas reconstituídos. Neste artigo, discutiremos protocolos gerais para marcação de spin dirigida ao local e reconstituição da membrana usando um canal iônico controlado por ligante pentamérico dependente de prótons procariótico (pLGIC) de Gloeobacter violaceus (GLIC) como exemplo. Uma combinação de abordagens EPR de onda contínua (CW) e pulsada (ressonância eletrônica de elétron duplo-DEER) em estado estacionário será descrita para permitir uma caracterização quantitativa completa da dinâmica do canal.

Introdução

Durante a última década, a compreensão estrutural dos canais iónicos dependentes de ligando pentaméricos (pLGIC) tem crescido nos trancos e barrancos, devido a multidões de estruturas de alta resolução de vários membros da família. Principais fatores que levaram aos avanços atuais no campo incluem a descoberta de canais pLGIC procariotas, ^1-3 grandes avanços na expressão de proteína de membrana eucariótica, ^4-6 e avanços tremendos em abordagens de determinação de estrutura. ⁷ Estas estruturas proporcionam um consenso claro sobre a conservação geral da arquitectura tridimensional de pLGIC. No entanto, duas grandes áreas que parecem arr....