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Química

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Published: July 04, 2016
doi:
10.3791/54127
, ,
1Department of Physiology and Biophysics,Case Western Reserve University, 2School of Medicine,Case Western Reserve University

Summary

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Abstract

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

Introduction

Durante a última década, a compreensão estrutural dos canais iónicos dependentes de ligando pentaméricos (pLGIC) tem crescido nos trancos e barrancos, devido a multidões de estruturas de alta resolução de vários membros da família. Principais fatores que levaram aos avanços atuais no campo incluem a descoberta de canais pLGIC procariotas, 1-3 grandes avanços na expressão de proteína de membrana eucariótica, 4-6 e avanços tremendos em abordagens de determinação de estrutura. 7 Estas estruturas proporcionam um consenso claro sobre a conservação geral da arquitectura tridimensional de pLGIC. No entanto, duas grandes áreas que parecem arrastar para trás são a caracterização funcional destas preparações de canal e a descrição mecanicista da função do canal.

Gating alterações conformacionais são complexos e ocorrem a uma distância de 60 Â ao longo do comprimento do canal e estas transições são extensivamente modulada pelalípidos de membrana. Em particular, lipidos negativos, colesterol e fosfolípidos foram mostrados para modular a função de pLGIC 8-11. Embora o papel preciso destes constituintes lipídicos na função do canal permanece desconhecida, uma compreensão completa molecular de gating exigiria estudar estes canais no seu ambiente nativo. Spin Dirigido local Labeling (SDSL) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) espectroscopia são as técnicas de escolha para o estudo da dinâmica de proteínas em sistemas reconstituídos. espectroscopia de EPR não é limitada pelo tamanho molecular (como é NMR) ou a propriedade óptica da amostra (como é a espectroscopia de fluorescência), e, assim, permite medições de construções de comprimento total reconstituído em condições nativas lipídicas. A técnica é extremamente sensível e tem requisitos relativamente baixos de amostra (no intervalo de pico-molar). Ambos estes aspectos tornar a técnica bem adequado para o estudo de proteínas de membrana grandes que são difíceis de expressar em mais miligramaquantidades.

A utilização de espectroscopia de EPR em combinação com marcação de spin dirigida ao local foi desenvolvido por Wayne Hubbell e colegas, e foi adaptado para o estudo de uma variedade de tipos de proteínas. 12-24 os dados de RPE foram utilizados para investigar estruturas secundárias, mudanças na proteína conformação, profundidades de inserção de membrana, e proteína-proteína / interacções proteína-ligando.

O método envolve a substituição de cisteína nas posições de interesse por mutagénese dirigida ao local. Para garantir a etiquetagem específica do local, é necessário substituir cisteínas nativas com outro aminoácido (por exemplo., Serina) para criar um modelo de cisteína-menos. De longe, o marcador de spin mais popular é um MTSL específico tiol-: (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metanotiosulfonato que se liga à proteína através de uma ponte de ligação de dissulfureto. Devido à sua elevada especificidade, de tamanho relativamente pequeno (ligeiramente maior do que o triptofano), e flexidade da região de ligante, este marcador de spin tem sido mostrado ter uma excelente reactividade, mesmo com uma cisteína enterrado. Além disso, para maximizar a reactividade, a reacção de marcação da proteína é realizada sob a forma detergente solubilizado. Depois da separação do excesso de rotação livre do rótulo por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, a proteína é reconstituído em lipossomas ou sistemas que mimetizam a bicamada lipídica de composição definida. Em geral, cisteína mutagênese é bem tolerada na maioria das partes da proteína, e o tamanho relativamente pequeno do spin-sonda provoca perturbação mínima para as estruturas secundárias e terciárias. Para assegurar que a modificação retido funções de tipo selvagem, os canais marcados e reconstituídas pode ser avaliado por medidas de patch-clamp.

A proteína marcada-funcional é então sujeita a medições espectroscópicas, que fornecem essencialmente três tipos principais de informação: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-sonda dinâmica por lineshanálise de macaco; acessibilidade da sonda para agentes de relaxamento paramagnético; e a distância de distribuição. 27 distâncias EPR são medidos por duas abordagens diferentes. A primeira baseia-se na técnica de onda contínua (CW), onde alargamento espectral resultantes de interacções dipolares entre spin-etiquetas (no 8 – gama de distâncias de 20 Â). É usada para determinar a distância 28,29 A segunda é uma pulsado-EPR método em que as medições de distância pode ser estendida até 70 Å. 30-34 em Duplo Electron Electron ressonância (DEER), oscilações na amplitude spin-echo são analisados ​​para determinar distâncias e distribuições de distância. Aqui o eco de spin é modulado na frequência da interação dipolar. Juntos, estes parâmetros são utilizados para determinar a topologia de proteína, elementos estruturais secundários, e as alterações da proteína-conformacional.

Protocol

1. Site-Directed Mutagênese e Cys Mutações Clonagem e mutagénese NOTA: GLIC tipo selvagem (wt) 35 tem uma única cisteína nativo (C27), que é mutado para serina para criar um fundo cisteína-menos. Mutações de cisteína são introduzidos no fundo de cisteína-menos por mutagénese dirigida ao local, utilizando iniciadores que transportam um codão de cisteína na posição 36 desejada. Dissolvem-se 5 ul de tampão 10x reacção, 1 ul de 100 ng / mL de cis…

Representative Results

Caracterização bioquímica dos Mutantes GLIC marcado por rotação Seguindo o protocolo descrito acima seria normalmente produzem proteína de fusão MBP-GLIC na gama de 10 – 12 mg / L de cultura. Embora este valor pode variar entre os diferentes mutantes, em particular para as posições enterradas no interior da proteína, o rendimento pode ser significativamente comprometida. Nestes casos, os volumes de c…

Discussion

espectroscopia EPR tem provado ser uma abordagem estrutural inigualável em quantificar mudanças conformacionais em proteínas de membrana em um ambiente quase nativo. Esta abordagem permite-nos uma espiada nos detalhes moleculares da dinâmica de proteínas que são obscurecidos em estruturas de alta resolução a partir de cristalografia de raios X e microscopia Cryo-elétron. No entanto, é importante considerar as limitações técnicas dessa abordagem que possa afetar a aplicabilidade geral para outros sistemas e …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muito gratos aos membros atuais e antigos do laboratório Chakrapani para leitura crítica e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção (1R01GM108921) e da American Heart Association (NCRP Scientist Desenvolvimento Grant 12SDG12070069) e SC.

Materials

Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
KH2PO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.Coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622
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Referências

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Keywords: Site Directed Spin LabelingEPR SpectroscopyPentameric Ligand-gated Ion ChannelsMembrane Protein DynamicsGLICSite-directed MutagenesisProtein PurificationCell LysisMembrane Protein Reconstitution
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Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).
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