Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.
Immunrespons resultat från ett komplext samspel mellan antigenet ospecifika medfödda immunsystemet och antigenet specifikt adaptiva immunsystemet. Immunsystemet är en konstant balans upprätthålla tolerans mot själv molekyler och reagera snabbt för patogener. Dendritiska celler (DC) är kraftfulla professionella antigenpresenterande celler som länkar det medfödda immunförsvaret att det adaptiva immunsystemet och balansera den adaptiva svar mellan själv och icke-själv. Beroende på mognadssignaler kan omogna dendritiska celler selektivt stimuleras att differentiera till immunogena eller tolerogena DC. Immunogena dendritiska celler ger spridningssignaler till antigenspecifika T-celler för klonal expansion; medan tolerogena dendritiska celler reglerar tolerans genom antigenspecifik deletion T-cell eller klonal expansion av regulatoriska T-celler. På grund av denna unika egenskap är dendritiska celler mycket eftertraktade som terapeutiska medel för cancer och autoimmuna diseases. Dendritiska celler kan laddas med specifika antigener in vitro och injiceras i människokroppen för att montera ett specifikt immunsvar både immunogen och tolerogena. Detta arbete presenterar ett sätt att generera in vitro från monocyter, omogna monocyt härledda dendritiska celler (moDCs), tolerogen och mogna moDCs som skiljer sig i ytan markör uttryck, funktion och metaboliska fenotyper.
DC beskrevs först av Paul Langerhans (Langerhans celler) i slutet av artonhundratalet som refereras av Jolles pt och kännetecknas av Ralph Steinman och Zanvil Cohn 1973 som kände igen dem som professionella antigenpresenterande celler 2. DCs finns i perifert blod och i de flesta vävnader i kroppen, särskilt riklig i vävnader som är utsatta för den yttre miljön, såsom huden (närvarande som Langerhans celler) och i foder i näsan, lungor, mage och tarmar som gör det möjligt dem att stöta yttre antigener. Omogna DC har endocytiska kapacitet men relativt låg kapacitet att stimulera T-celler 3. Omogna DC uttrycka olika mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) som fångar patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) eller skada associerade molekylära mönster (dämpas) 4. Aktivera varningssignaler kör mognad mot immunogena DC medan själv molekyler resulterar i T-cells unresponsiveness och apoptos 5. Immunogena DCs kännetecknas av uppreglering av MHC-molekyler och sam-stimulerande ytmolekyler och deras förmåga att prime naiva T-celler 6,7.
Omogna DC kan också mognat till en Treg framkallande eller tolerogena tillstånd som svar på vitamin D3-metaboliten 1a, 25 (O) 2 D3 och vissa immunosuppressiva medel som interleukin-10 (IL-10), dexametason och rapamycin 8-9. Tolerogena DCs kännetecknas av sin expression av immunoreceptor tyrosin-baserade inhiberande motiv (ITIMs) innehållande ytreceptorer och ligander. Signalöverföring av ITIMs innehåller ILT familjemedlemmar, ILT3 och ILT4 i tolerogena DCs hämmar alloproliferation och kör Foxp3 + Treg expansionen 10,11. Dessa unika egenskaper hos tolerogena DCs leda till att de djupgående potens in vivo, nämligen förmågan att inducera varaktig tolerans mot transplanterade allogena transplantat och supprESS utvecklingen av autoimmuna sjukdomar. Tolerogen DCs kan ses därför som en subtyp av mogna polariserade DCs som fungerar på hämning av immunaktivering.
För närvarande finns det två allmänna undergrupper av dendritiska celler i humant perifert blod: plasmacytoid DCS och myeloida DCs 12. Cirkulerande DCs är sällsynta utgör till mindre än 2% av leukocyter i blod från människa, och detta utgör en svårighet till isolering av ett lämpligt antal DC: er att studera deras immunregulatoriska funktioner. För att övervinna detta problem, är monocyt differentierade DCs används som en modell för studier av dendritisk cellfunktion in vitro. Dessa in vitro DCs har liknande receptorer och funktioner jämfört med in vivo DC. Detaljerad jämförelse av in vivo DCs och som härstammar från monocyter in vitro genererade DC (moDCs) undersöks av andra laboratorier 13, 14, 15. Det har också rapporterats att moDCs och CD1c + DC var motsvarande vid antigenpresenterande och inducera T-cellsfunktionen 15.
I detta dokument beskriver vi en metod för att generera omogna moDCs från perifera blodmonocyter och därefter differentiera dem till immunogena och tolerogena DCs. Dessa härstammar från monocyter dendritiska celler (moDCs) kännetecknas av deras ytmarkörer, cytokin profil, immunreglerande funktioner och metaboliska tillstånd. Immunogena och tolerogena dendritiska celler producerar olika cytokiner som resulterar i expansion av antingen allogena T-celler eller regulatoriska T-celler. I detta dokument är cytokin profilering utförs med system som använder multiplex teknik. Tillväxtmediet för celler inkuberas med antikropp immobiliserad färgkodade pärlor och läsa i en kompakt analysator. Metabola stater DCs analyseras med extracellulära flödesmätare som mäter syreförbrukningen, en indikator på cellandning, och extracellulära försurning takt som speglar glykolytiskaflux i dendritiska celler. Mätning av dessa priser bioenergetik ger en möjlighet att spåra förändringar i cellulär metabolism som är viktiga i dendritiska celler utveckling och funktion.
Detta dokument beskriver en metod för att generera från monocyter omogna moDCs, tolerogena moDCs och mogna moDCs. De viktiga stegen i detta protokoll diskuteras i detalj i de följande styckena. Det är viktigt att notera att humant perifert blod används som utgångsmaterial i detta protokoll och universella försiktighetsåtgärder för hantering av mänskligt blod bör praktiseras. Även om det är tekniskt möjligt att härleda DC från benmärg hos människor 24 är DC differentiering från celler som finns i perifert blod in vitro att föredra på grund av tillgången till perifert blod jämfört med benmärg. Bland de celler som återfinns i perifert blod, är hematopoietiska CD34 + stamceller och monocyter som vanligen används för generering av DC: er in vitro. Hematopoietiska CD34 + stamceller odlas med GM-CSF och TNF-α att härleda CD1a + och CD14 + subuppsättningar, vilka sedan ytterligare differentieras till Langerhansliknande celler och dendritiska celler. Omvänt, monocyter odlas i GM-CSF och IL-4 för att generera omogna moDCs. Flera protokoll används för anrikning av monocyter från perifert blod; t ex genom anslutning till plastskålar, elutriation och isoleringssatser 25, 26 Fördelarna med följsamhet protokollet är minimal skada på celler och relativt kostnadseffektiv men cell renhet kan äventyras. och en extra steg krävs för att lösgöra cellerna för ytterligare experiment. Slamning är en teknik som separerar celler baserat på deras storlek och täthet. Fördelarna med slamning är cellviabiliteten och monocyter lätt kan användas för ytterligare experiment; emellertid denna teknik är begränsad genom tillgängligheten av en elutriator och oförmågan att separera olika populationer av celler (T-celler och monocyter) med liknande sedimenteringsparametrar. Kommersiellt tillgängliga isolerings kit använder magnetiska mikropärlor till antingen positivt välja ellerVälj den monocytiska befolkningen negativt. Vissa protokoll är förspända mot monocyt isolering med hjälp av negativt urval som isolerade monocyter förblir "orörd" (inte bundet av markörer eller mikropärlor). I detta protokoll, var CD14 pärlor användes till positiva utvalda humana monocyter från PBMC. CD14 saknar en cytoplasmatisk domän och bindning av antikropp till CD14 utlöser inte signaltransduktion. Dessutom kommer mikropärlorna lossnar från monocyter efter kultur och därmed hindrar inte differentieringsprocessen. Dessutom är CD14 uttrycks starkt på de flesta monocyter och svagt på neutrofiler och vissa myeloida dendritiska celler, hence denna metod för isolering resulterar i högre cell renhet än de andra metoderna 17.
Blodmonocyter kan differentieras till DC eller makrofager och öde monocyter beror i hög grad på cytokin miljön. I detta dokument är moDCs genereras genom tillsats av granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) Och interleukin 4 (IL-4) till humana perifera blodmonocyter. GM-CSF krävs för monocyt överlevnad och IL-4 utövar en hämmande aktivitet på makrofagdifferentiering; och kombinato tillsats av GM-SCSF och IL-4 till monocyter ger en högre procentandel av omogna moDCs jämfört med individuell cytokin 27. Det finns andra protokoll som genererar moDCs genom tillsats av tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), interferon-alfa (IFN-α) och interleukin 13 (IL-13) till perifera blodmonocyter 28, 29, 30. Kombinationen av GM-CSF och IL-4 har optimerats på 1990-talet och nu ett erkänt protokoll som genererar plast omogna DC differentierade till immunogena eller tolerogena moDCs och polariserade i Th1, Th2 eller Th17 främjar moDCs.
Omogna moDCs differentieras till tolerogena moDCs genom tillsats av vitamin D3 och dexametason. Det finns flera protokoll att generera tolerogena DC till exempel vianukleär faktor-kappa B (NF-kB) hämning, β-catenin aktivering, vitamin D3, dexametason och Rapamycin 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Även om både vitamin D3 och dexametason ensamt har rapporterats att inducera en tolerogen effekt på DCs, kombinationen av vitamin D3 och dexametason resulterar i en större dämpning av alloproliferation än när enskilda läkemedel används. Därför var det existerande protokoll för generering av tolerogena DCs modifierad för att en kombination av vitamin D3 och dexametason. Denna metod är för närvarande accepteras som en modell för mänskliga tolerogena DCs med terapeutisk användbarhet. Det är också viktigt att notera att den rekonstituerade Vitamin D3 och dexametason har en kort hållbarhetstid.
I detta protokoll, var Lipopolysackarider (LPS) tillsattes som en DC-mognad inducerare. Omogna moDCs kan också förmås att mognad att använda pro-inflammatoriska cocktail:(TNF-α), interleukin 1 beta (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) och prostaglandin E2) eller pro-inflammatoriska cytokiner (TNF-a och interferon gamma (IFN-Γ)). Proinflammatorisk cocktail genererar mogna moDCs med hög samstimulerande och flyttande funktioner men de producerar relativt låga nivåer av IL-12 38. TNF-α eller IFN-Γ är ensamt inte inducera en stabil dendritisk fenotyp 39. LPS stimulerar Toll-like receptor 4 (TLR4), förmedlar aktivering av NF-kB och mitogenaktiverat proteinkinaser (MAPK) att inducera DC mognad. DC mognad som induceras av LPS visar en upp-reglering av likströmsmognads markörer (CD83, CD86, HLA-DR) och ledde också till produktion av IL-12p70. Dessutom kan detta steg modifieras ytterligare för att koppla ihop LPS med TLR3 agonister för att producera mogna DC för kliniska cancervacciner. I detta dokument är tolerogena DCs visat sig vara resistent mot mognad på LPS behandling. Dessa semi mogna som DC är inte immunogena och inte ReleaSE proinflammatoriska cytokiner 40.
Begränsningarna i detta protokoll ligga i differentieringsprocessen. Processen tar 8 dagar från dag 0 till dag 7 som utgör en svårighet anpassas till hög genomströmning analyser. En modifiering i protokollet är skyldig att förkorta differentieringsprocessen ännu ge ett stort antal livskraftiga DC i de olika staterna. För det andra är DCs genereras genom tillsats av cytokiner i detta protokoll och dessa cytokiner inte upprätthålla DC population för lång tid. Dessutom är cytokiner användas i koncentrationer mycket högre än in vivo och skulle kunna resultera i förspänd utveckling av banor som inte är fysiologiskt identiska med in vivo-DCs. Till exempel in vitro kulturer av DC prekursorer har visat sig svara på GM-CSF, som inte är en väsentlig cytokin för normal DC differentiering in vivo 41. Ändå kan cytokinstimulering vara en användbar metod för att genengradera ett stort antal DC in vitro för experiment. Förmågan att utsätta dessa celler som genereras från detta protokoll till andra analyser såsom immunofluorescens färgning, flödescytometri, allo reaktionsstudier och metaboliska studier ökar användbarheten av denna metod. Dessa in vitro DCs tjäna som en bra modell för att förbättra kunskapen om DC utveckling, mognad och antigenpresentation som är tidigare svårt att göra med de sällsynta antal in vivo DC.
DCs förmåga att reglera immunologisk immunitet mot tolerans gör dem attraktiva kandidater i terapi mot cancer och autoimmuna sjukdomar 42, 43, 44, 45. Immunogena DC genereras i detta protokoll kan användas för att förbättra vaccinations effekt mot infektionssjukdomar och tumörer; medan tolerogena DCs kan användas för att styra cellsvar oönskad T och förhindra avstötning efter transplantation. den intrikatabalans mellan immunitet och tolerans beror oerhört på DC differentieringsstatus. DC differentiering är ett samordnat cellulär program som styrs av flera signalvägar och metabolism. Olika differentieringstillstånd DC skiljer sig bioenergetiska och biosyntes behov; till exempel aktiverade DCs kräver mer energiska metaboliska anpassningar viktiga för överlevnad och migration jämfört med utvecklingsländerna i vilotillstånd. Det är viktigt att notera att vitamin D3, dexametason och rapamycin är kända för sin förmåga att inducera tolerogena DC, har beskrivits att påverka DC metabolism. I detta papper, var den energiska metabolism moDCs från olika differentieringstillstånd som kännetecknas med hjälp av extracellulära flödesmätare och tolerogena moDCs uppvisade den högsta metaboliska plasticitet och LPS-inducerad mognaden minskade denna plasticitet. Anabola metabolism stöder DCs mognad medan katabola metabolism påverkar tolerogena DC fungerar 46. DCSgenereras från detta protokoll kan användas för att bedöma huruvida ändra metaboliska tillstånd av DC håller nyckeln till att modifiera immunitet och tolerans i terapi. Avslutningsvis presenterade vi ett protokoll för generering av omogna, tolerogen och mogna moDCs avgörande för att studera DCS "immunfunktioner.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av byrån för vetenskap, teknologi och Reasearch basfinansiering (till JEC).
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | PBMC isolation |
Syringe | Becton, Dickinson | 302832 | PBMC isolation |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | PBMC isolation |
15 mL falcon tube | Falcon | 352096 | PBMC isolation |
50 mL falcon tube | Falcon | 352070 | PBMC isolation |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | PBMC isolation |
0.2 µm filter | Sartorius stedim biotech | 17597 | PBMC isolation |
MACs kit | Miltenyi biotec | 130-042-201 | Monocyte enrichment |
MiniMACS Separator | Miltenyi biotec | 130-042-102 | Monocyte enrichment |
Cell culture grade water | Invitrogen, Life Technologies | Cell culture | |
RPMI | Gibco, Life Technologies | 11875-093 | Cell culture |
FBS | Hyclone | SH30070103 | Cell culture |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140 | Cell culture |
Phosphate Buffered Saline |
Gibco, Life Technologies | 10010-031 | Cell culture |
NEAA | Gibco, Life Technologies | 11140-040 | Cell culture |
EDTA | Gibco, Life Technologies | 15575 | Cell culture |
HEPES | Gibco, Life Technologies | 15630-080 | Cell culture |
Sodium Pyruvate | Gibco, Life Technologies | 11360-070 | Cell culture |
GM-CSF | Miltenyi biotec | 130-093-868 | Cell culture |
IL-4 | Miltenyi biotec | 130-093-924 | Cell culture |
Vitamin D3 | Sigma | D1530 | Cell culture |
Dexamethasone | Sigma | D2915 | Cell culture |
LPS | Sigma | l2755 | Cell culture |
trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
PerCP-conjugated HLADR | BioLegend | 307628 | Cytometry |
PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Cytometry |
PE-conjugated CD83 | BD Biosciences | 556855 | Cytometry |
PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Cytometry |
APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Cytometry |
PE-conjugated CD14 | Miltenyi biotec | 130-091-242 | Cytometry |
PE-conjugated BDCA3 | Miltenyi biotec | 130-090-514 | Cytometry |
APC-conjugated ILT3 | eBioscience | 12-5139-73 | Cytometry |
Isotype matched PerCP- conjugated Mab |
BioLegend | 400250 | Cytometry |
Isotype matched PE- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-835 | Cytometry |
Isotype matched APC- conjugated Mab |
Miltenyi biotec | 130-091-836 | Cytometry |
BD LSR II Flow Cytometer | BD Pharmingen | BD LSR II | Cytometry |
cytofix/cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Cytometry |
APC/CY7-conjugated CD25 | BD pharmingen | 557753 | Cytometry |
PE/CY7-conjugated CD4 | Biolegend | 300512 | Cytometry |
PerCP-conjugated CD3 | Biolegend | 300428 | Cytometry |
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit | STEMCELL Technologies | 19052 | Alloreaction study |
EasySep magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | Alloreaction study |
Cell Trace CFSE cell proliferation kit | Molecular probes | C34554 | Alloreaction study |
HBSS | Gibco, Life Technologies | 14025092 | Alloreaction study |
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 | BD Biosciences | 560889 | |
Milliplex MAP Human Cytokine/Chemokine magnetic bead panel |
Millipore | HCYTOMAG-60K | Cytokine analysis |
5 mL Polystyrene tube | Falcon | 352058 | Cytokine analysis |
Luminex Sheath Fluid | Millipore | SHEATHFLUID | Cytokine analysis |
FLEXMAP 3D system with xPONENT software | Luminex Corporation | FLEXMAP 3D | Cytokine analysis |
MitoTracker Red CMXRos | Cell Signalling | 9082 | Mitochondrial activity |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | Mitochondrial activity |
XF Assay Medium (OCR) | Seahorse Bioscience | 102352-000 | Metabolic adaptation |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | Metabolic adaptation |
XF Base Medium (ECAR) | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Metabolic adaptation |
L-glutamine | Gibco, Life Technologies | 25030-081 | Metabolic adaptation |
Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Metabolic adaptation |
XF Cell Mito Stress kit | Seahorse Bioscience | 103015-100 | Metabolic adaptation |
XF Glycolysis Stress kit | Seahorse Bioscience | 103020-100 | Metabolic adaptation |
Seahorse | Seahorse Bioscience | XFe96 | Metabolic adaptation |