Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Abstract

Methylierungs ist eines der wesentlichen epigenetische Modifikationen an der DNA, die für die genaue Regulierung von Genen verantwortlich ist, die für eine stabile Entwicklung und Differenzierung von verschiedenen Gewebetypen. Dysregulation dieses Verfahrens ist oft das Kennzeichen von verschiedenen Krankheiten wie Krebs. Hier haben wir eine der jüngsten Sequenzierungstechniken skizzieren, Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), verwendet Methylierung in für große Patientenkohorten verschiedenen normalen und Krankheit Gewebe zu quantifizieren. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll dieser Affinitätsanreicherung Ansatz zusammen mit einer Bioinformatik Pipeline optimale Quantifizierung zu erreichen. Diese Technik ist verwendet worden Hunderte von Patienten in verschiedenen Krebsarten als Teil der 1000 Methyloms Projekt (Cancer Methylome System) zu sequenzieren.

Introduction

Epigenetischen Regulation der Gene durch DNA – Methylierung ist eine der wesentlichen Mechanismen erforderlich , um die Zellschicksal durch stabile Differenzierung verschiedener Gewebearten in dem Körper ¹ zu bestimmen. Dysregulation dieses Verfahrens wurde ² verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs zu verursachen bekannt.

Dieses Verfahren umfasst im Wesentlichen die Zugabe von Methylgruppen auf dem Cytosin – Rest in der CpG Dinukleotide DNA ^3. Es gibt verschiedene Techniken , die derzeit diesen Mechanismus zu untersuchen, die jeweils ihre eigenen Vorteile, wie ^2-8 in vielen Studien beschrieben. Hier werden wir eine dieser Techniken diskutieren namens Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), wo wir eine Affinität Anreicherungsmethode verwenden, um methylierte Bereiche der DNA zu identifizieren. Diese Technik baut auf dem methyl-Bindungsfähigkeit des MBD2-Proteins für die genomische DNA-Fragmente enthalten, methylierte CpG-Stellen zu bereichern. Wir verwenden eine kommerzielle methylierte DNA-Anreicherung Kitfür die Isolierung dieser methylierten Regionen. Unser Labor hat Hunderte von Patientenproben mit dieser Technik gezeigt und hier bieten wir ein umfassendes optimiertes Protokoll, das verwendet werden kann große Patientengruppen zu untersuchen.

Wie sich bei jeder Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation erfordert MBDCap-seq auch einen spezifischen Ansatz der Bioinformatik, um das Niveau der Methylierung in den Proben genau zu quantifizieren. Es wurden in dem Bemühen viele neuere Studien, die Normalisierung und Analyseprozess der Sequenzierungsdaten ^{9, 10} zu optimieren. In diesem Protokoll zeigen wir eine dieser Methoden eine einzigartige Lese Recovery-Ansatz der Umsetzung – LONUT – gefolgt von linearen Normalisierung jeder Probe, um unvoreingenommene Vergleiche über große Anzahl von Patientenproben zu ermöglichen.

Protocol

Alle Gewebe erhalten nach der Zustimmung des Institutional Review Board Ausschuss und, wenn alle Teilnehmer zugestimmt sowohl der molekularen Analysen und Follow-up-Studien. Die Protokolle werden von der Human Studies Committee an der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt. 1. Methyl-bindende DNA-Capture (MBDCap) Probenentnahme und DNA – Isolierung Sammeln Sie Bulk-Tumor oder normalen Gewebeproben von Patienten Paraffingewebeproben…

Representative Results

Wir haben MBDCap-seq verwendet , um DNA – Methylierungs Veränderungen in einer großen Anzahl von Patienten , die an verschiedenen Krebsarten einschließlich Brust- 12, endometrial 13, der Prostata 14 und Leberkrebs unter anderem studieren. Hier zeigen wir einige Informationen aus der Studie Brustkrebs vor kurzem 12 veröffentlicht. In diesem Fall haben wir das gesamte Genom-Sequenzierung Ansatz zu CpG-Inseln zu identifizieren, die in den normalen bezüglich der Tumor in verschiedenen genomischen…

Discussion

Die MBDCap-seq – Technik ist eine Affinitätsanreicherung Ansatz ³ als kostengünstige Alternative angesehen , wenn Kohorten mit einer großen Anzahl von Patienten ¹⁵ zu untersuchen. Die Pipeline präsentiert hier beschreibt einen umfassenden Ansatz von der Probenbeschaffung bis zur Datenanalyse und Interpretation. Einer der wichtigsten Schritte setzt ein PCR-Amplifikationsverfahren, um die Effizienz der PCR GC angereicherte Regionen in dem Genom zu verbessern, da dies ist, wo die DNA-Methylierung stattfindet. Auch ist…

Materials

Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3M sodium acetate pH 5.2	Sigma	S7899	100ml
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina