Her presenterer vi en protokoll for å undersøke genome wide DNA metylering i storskala klinisk pasientscreeningstudier ved hjelp av metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq eller MBD-seq) teknologi og påfølgende bioinformatikk analyse rørledning.
Metylering er en av de essensielle epigenetiske modifikasjoner av DNA, som er ansvarlig for nøyaktig regulering av gener som er nødvendige for stabil utvikling og differensiering av forskjellige vevstyper. Dysregulering av denne prosessen er ofte kjennetegnet av forskjellige sykdommer som kreft. Her skisserer vi en av de siste sekvense teknikker, metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq), som brukes for å kvantifisere metylering i ulike normale og sykdom vev for store pasient kohorter. Vi beskriver en detaljert protokoll av denne affinitet anrikning tilnærming sammen med en bioinformatikk rørledning for å oppnå optimal kvantifisering. Denne teknikken har blitt brukt for å sekvensere på flere hundre pasienter på tvers av ulike cancertyper som en del av den 1000 methylome prosjektet (Cancer Methylome System).
Epigenetisk regulering av gener som gjennom DNA-metylering er en av de grunnleggende mekanismer som er nødvendige for å bestemme den celle skjebnen ved stabil differensiering av forskjellige typer vev i kroppen en. Dysregulering av denne prosessen har vært kjent for å forårsake forskjellige sykdommer, inkludert kreft 2.
Denne prosessen innebærer i hovedsak tilsetning av metylgrupper i cytosin resten i CPG-dinukleotider av DNA-3. Det finnes flere ulike teknikker som i dag brukes for å undersøke denne mekanismen, som hver har sine egne fordeler som skissert i mange studier 2-8. Her vil vi diskutere en av disse teknikkene kalles metyl-Binding DNA Capture sekvensering (MBDCap-seq), hvor vi bruker en tilhørighet berikelse teknikk for å identifisere denaturert regioner av DNA. Denne teknikk bygger på den metyl-bindingsevnen av proteinet MBD2 for å anrike for de genomiske DNA-fragmenter inneholdende metylerte CpG-områder. Vi bruker en kommersiell metylert DNA berikelse kitfor isolering av disse metylert regionene. Vårt laboratorium har vist hundrevis av pasientprøver ved hjelp av denne teknikken, og her gir vi en omfattende optimalisert protokollen, som kan brukes til å undersøke store pasient kohorter.
Som tydelig med noen neste generasjons sekvenseringsteknologi, MBDCap-seq krever også en bestemt bioinformatikk tilnærming for å nøyaktig kvantifisere nivåene av metylering over prøvene. Det har vært mange nylige studier i et forsøk på å optimalisere normalisering og analyseprosessen av sekvenseringsdataene 9, 10. I denne protokollen, viser vi en av disse metodene implementere en unik lese utvinning tilnærming – LONUT – etterfulgt av lineær normalisering av hver prøve for å gjøre det mulig objektive sammenligninger mellom stort antall pasientprøver.
Den MBDCap-seq teknikk er en tilhørighet berikelse tilnærming 3, regnes som et kostnadseffektivt alternativ når etterforsker kohorter med et stort antall pasienter 15. Rørledningen som presenteres her beskriver en helhetlig tilnærming fra prøve innkjøp til dataanalyse og tolkning. Et av de viktigste trinn er å sette opp en PCR-amplifisering fremgangsmåte for å forbedre effektiviteten av PCR GC anriket regioner i genomet som dette er hvor DNA-metylering inntreffer. Dessuten er det viktig å sikre at etter sekv…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet er støttet av CPRIT Forskerutdannings Award RP140105, samt delvis støttet av amerikanske National Institutes of Health (NIH) innvilger R01 GM114142 og William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |