Metyl-bindande DNA fånga sekvensering för patientvävnader

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka genomet bred DNA-metylering i storskaliga kliniska patientscreeningstudier med hjälp av metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter eller MBD-punkter) teknik och efterföljande bioinformatik analys pipeline.

Abstract

Metylering är en av de väsentliga epigenetiska modifieringar av DNA, som är ansvarig för den exakta regleringen av gener som krävs för stabil utveckling och differentiering av olika vävnadstyper. Dysreglering av denna process är ofta kännetecknande för olika sjukdomar som cancer. Här, vi beskriva en av de senaste sekvenseringstekniker, metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter), som används för att kvantifiera metylering i olika normala och sjukdoms vävnader för stora patientgrupper. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för denna affinitetsanrikning tillvägagångssätt tillsammans med en bioinformatik pipeline för att uppnå optimal kvantifiering. Denna teknik har använts för att sekvensera hundratals patienter inom olika cancertyper som en del av den 1000 methylome projektet (Cancer Methylome System).

Introduction

Epigenetisk reglering av gener genom DNA-metylering är en av de väsentliga mekanismer som krävs för att bestämma cell öde genom stabil differentiering av olika vävnadstyper i kroppen ^1. Dysreglering av denna process har varit kända för att orsaka olika sjukdomar inklusive cancer ^2.

Denna process innebär främst tillsättning av metylgrupper på cytosin rester i CpG-dinukleotider i DNA ^3. Det finns några olika tekniker som för närvarande används för att undersöka denna mekanism, var och en har sina egna fördelar som beskrivs i många studier ^2-8. Här kommer vi att diskutera en av dessa tekniker kallas metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter), där vi använder en affinitetsanrikning teknik för att identifiera denaturerad regioner av DNA. Denna teknik bygger på metyl-bindningsförmågan hos MBD2-proteinet för att anrika de genomiska DNA-fragment innehållande metylerade CpG platser. Vi använder en kommersiell metylerat DNA anrikning kitför isolering av dessa metylerade regioner. Vårt laboratorium har screening hundratals patientprover med denna teknik och här erbjuder vi en omfattande optimerat protokoll, som kan användas för att undersöka stora patientgrupper.

Som framgår med någon nästa generations sekvenseringsteknologi, MBDCap-punkter kräver också en specifika bioinformatik strategi för att exakt kvantifiera nivåerna av metylering över proven. Det har varit många nya studier i ett försök att optimera normalisering och analysprocessen av de sekvensdata ^{9, 10.} I detta protokoll visar vi en av dessa metoder som genomför en unik läsning återhämtning strategi – LONUT – följt av linjär normalisering av varje prov för att möjliggöra objektiva jämförelser mellan stort antal patientprover.

Protocol

Alla vävnader erhålls efter godkännande av Institutional Review Board kommitté och när alla deltagare samtyckt till både molekylära analyser och uppföljningsstudier. Protokollen är godkända av Human Studies kommittén vid University of Texas Health Science Center i San Antonio. 1. Metyl-bindande DNA Capture (MBDCap) Provsamling och DNA-isolering Samla bulk tumör eller normala vävnadsprover från patienter paraffininbäddade vävnadsprover. Använda ett k…

Representative Results

Vi har använt MBDCap-seq för att studera DNA-metylering förändringar i ett stort antal patienter från olika cancertyper inklusive bröst 12, endometrial 13, prostata 14, och levercancer bland andra. Här visar vi lite information från bröstcancer studie som publicerades nyligen 12. I detta fall har vi använt hela genomet sekvense metod för att identifiera CpG-öar som differentiellt metylerade i tumörer med avseende på normal mellan olika genomiska regioner. Undersökningen visade att a…

Discussion

Den MBDCap-punkter teknik är en affinitetsanrikning metod ^3, betraktas som ett kostnadseffektivt alternativ vid utredning kohorter med ett stort antal patienter ^15. Rörledningen som presenteras här beskriver en övergripande strategi från prov upphandling dataanalys och tolkning. En av de viktigaste stegen är att inrätta en PCR-förstärkning förfarande för att främja PCR effektivitet GC berikade områdena i genomet eftersom det är där DNA-metylering förekommer. Dessutom är det viktigt att se till att efte…

Materials

Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3M sodium acetate pH 5.2	Sigma	S7899	100ml
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina