Fænotypisk og funktionel analyse af Aktiverede Regulatory T celler isoleret fra kronisk lymfatisk choriomeningitisvirus-inficerede mus

Summary

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (T_reg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the T_reg cells.

Abstract

Regulatoriske T (T _reg) celler, som udtrykker Foxp3 som en transskriptionsfaktor, er delmængder af CD4 ⁺ T-celler. T _reg celler spiller afgørende roller i immun tolerance og homeostase vedligeholdelse ved at regulere immunresponset. Den primære rolle af T _reg celler er at undertrykke proliferationen af effektor-T (T _eff) celler og produktionen af cytokiner, såsom IFN-γ, TNF-α og IL-2. Det er blevet påvist, at T _reg cellers evne til at inhibere funktionen af T _eff celler forstærkes under vedvarende patogen infektion og cancerudvikling. For at tydeliggøre funktionen af T _reg celler under hvilende eller betændte tilstande, en række forskellige in vitro suppression assays under anvendelse af muse eller human T _reg celler er blevet udtænkt. Hovedformålet med denne undersøgelse er at udvikle en metode til at sammenligne forskellene i fænotype og undertrykkende funktion mellem hvilende og aktiverede T _regceller. For at isolere aktiverede T _reg celler blev mus inficeret med lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) klon 13 (CL13), en kronisk stamme af LCMV. T _reg celler isoleret fra milten fra LCMV CL13-inficerede mus udviste både den aktiverede fænotype og forøget undertrykkende aktivitet sammenlignet med hvilende T _reg celler isoleret fra naive mus. Her beskriver vi den grundlæggende protokol for ex vivo fænotype-analyse for at skelne aktiverede T _reg celler fra hvilende T _reg celler. Desuden beskriver vi en protokol til måling af den undertrykkende aktivitet fuldt aktiverede T _reg celler.

Introduction

Regulatoriske T (T _reg) celler udtrykker forkhead kasse P3 (Foxp3) som en transskription faktor for deres udvikling og funktion ^1. Derudover T _reg celler udtrykker forskellige andre molekyler, såsom CD25 ^2, lymfocyt-aktivering gen 3 (LAG-3) ^3, glucocorticoidinduceret tumornekrosefaktorreceptor ^4, og cytotoksisk T-lymfocyt-associeret protein 4 (CTLA-4) ⁵ på deres overflade eller intracellulære område. Under kronisk infektion med forskellige former for patogener såsom vira ^6,7, bakterier ^8,9 og parasitter ^10-12, eller i løbet af kræft udvikling ^13,14, bliver T _reg celler differentieret i aktiverede celler, viser forbedret undertrykkende funktion målretning effektor CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celler. En række papirer har antydet, at ekspanderede og aktiverede T _reg celler bidrager til de forringede CD8 ⁺ T-celle-response under ven retrovirus (FV) infektion ^15-17. FV-inducerede T _reg celler inhiberer IFN-γ eller granzym B-ekspression og cytotoksisk reaktivitet af CD8 ^{+ -T-celler 15-17.} Desuden er der i en herpes simplex virus infektion model, blev det rapporteret, at udtømningen af CD4 ⁺ CD25 ^{+ _{-T-reg-celler}} resulterede i en udvidelse af virus-specifikke CD8 ⁺ T-celler og alvorlig vævsbeskadigelse ved infiltration af immunopathogenic CD4 ^{+ -T-celler 18-20.}

Mus inficeret kronisk med klonen 13-stammen af lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV CL13) ^21-24 er ofte blevet brugt til at karakterisere fænotypen og funktion af effektor T-celler (T _EFF) og T _reg celler under kronisk virusinfektion. Under vedvarende LCMV-infektion, virus-specifikke T _eff celler gradvist mister deres effektorfunktion og blive udmattet T _(Texh) celler. På den anden side, T_reg celler styrke deres evne til at undertrykke virus-specifikke T-celle respons ^25. Faldet i funktion kapacitet af T _eff celler kan forklares ved adskillige faktorer, såsom opregulering af inhiberende receptorer på T _eff celler, ændret funktion af antigen-præsenterende celler, produktion af immunregulatoriske cytokiner, og øget frekvens eller forstærket funktion af T _reg celler ^26. Blandt de er involveret i T-celle-suppression faktorer, programmeret celledød protein-1 (PD-1) udtrykkende _Texh celler og T _reg celler er blevet bredt betragtes som kendetegnende for antigen persistens og undertrykkende miljø. For nylig blev det rapporteret, at blokade af PD-1-vejen og ablation af T _reg celler føre til øget T-cellefunktion og nedsat viral belastning under LCMV kronisk infektion ^27. Desuden er T _reg celler aktiveres under kronisk infektion af mus med LCMV ^23,25 </sop> og deres undertrykkende funktion styrkes ^25. PD-1 er overudtrykt på T _reg celler såvel som _Texh celler, og niveauet af PD-1 udtrykt af T _reg celler korrelerer med styrken af deres supprimerende funktion at inhibere T-celleproliferation ^25.

Her beskriver vi en metode til at sammenligne egenskaberne af aktiverede T _reg celler isoleret fra mus inficeret med LCMV CL13 og hvilende T _reg celler isoleret fra naive mus. Endvidere forklarer vi en række processer til at adskille aktiverede T _reg celler og undersøger deres ex vivo fænotype, samt måle deres supprimerende aktivitet in vitro.

Protocol

I denne undersøgelse blev mus holdt i en SPF-facilitet i Yonsei Laboratory Animal Research Center i Yonsei Universitet. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de koreanske Food and Drug Administration retningslinjer hjælp protokoller er godkendt af International Animal Care og brug Udvalg Yonsei Laboratory Animal Research Center ved Yonsei Universitet. 1. Fremstilling af opløsninger Forbered 2% RPMI medier ved fortynding føtalt bovint serum (FBS) til 2% og …

Representative Results

Vi genererede mus med vedvarende virusinfektion ved at indsprøjte dem med 2 x 10 6 pfu af LCMV CL13 intravenøst. For at undersøge de fænotypiske ændringer i T reg celler og T conv celler under kronisk virusinfektion, blev milt-lymfocytter opnået fra naive og inficerede mus farvet med forskellige antistoffer og analyseret ved flowcytometri. Ved 16 d pi, blev PD-1 opreguleres i både Foxp3 – CD4 + T conv (figur…

Discussion

Selvom der findes kun et lille antal af T _reg celler i mus og mennesker, er det vigtigt at forstå deres funktion som de spiller en afgørende rolle i reguleringen af immunresponset og opretholdelse immuntolerance. Antallet og undertrykkende funktioner T _reg celler stiger i løbet af en kronisk virusinfektion ^15-20 samt kræft progression ^13,14. Dette er sandsynligvis på grund af fortsat antigenstimulering. At evaluere T _reg celler fungerer under antigen persistens…

Materials

FITC Rat Anti-Mouse CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714	Use this reagent for cell surface staining.
U-Bottom Tissue Culture Plates		BD Biosciences	353077
Fixation buffer		BD Biosciences	554655	Use this reagent for cell surface staining.
FITC Rat Anti-Mouse CD25	7D4	BD Biosciences	553072	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cell strainer, 70mm		BD Biosciences	352350	Use this strainer for grinding the whole spleen.
Cell strainer, 40mm		BD Biosciences	352340	Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Life Sciences	SH30027
PBS (1X)		GE Life Sciences	SH30256
ACK Lysing Buffer		Gibco	A10492-01
L-Glutamine, 200mM solution		Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit		Life technologies	L-34975	Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns		Miltenyibiotec	130-042-901	Use this column for Treg cell isolation
MACS Separation Columns, LS columns		Miltenyibiotec	130-042-401	Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation
EDTA, 0.5M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Mercaptoethanol		Sigma Life Science	M7522
Fetal Bovine Serum		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II flowcytometer		BD Biosciences		Flow cytometer*
Flowjo		TreeStar		Flow cytometry software†
Hematocytomer		Marienfeld superior