We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.
Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.
Antistoffer af IgM-isotypen demonstrere stort terapeutisk potentiale til behandling af forskellige sygdomme, herunder cancer og CNS-lidelser 1-7. Den Vollmers 'gruppe identificeret talrige antistoffer i cancerpatienter til potentiel anvendelse som tumorspecifikke biomarkører eller aktive terapeutiske midler, der er i stand til at dræbe maligne celler ved at inducere apoptotiske veje 4,8,9. Interessant, alle identificerede antistoffer med terapeutisk potentiale er af IgM-isotypen og tilhører gruppen af "naturlige autoantistoffer" (NABS).
Tilsvarende Rodriguez gruppe identificeret muse og humane antistoffer, der stimulerer remyelinering i kronisk demyeliniserede rygmarvslæsioner i modeller for dissemineret sklerose (MS). Identisk med antistoffer med anti-cancer effekt, alle remyelinering-fremmende antistoffer er NABS og IgM-isotypen 1,6,7,10. De præcise antigener til de fleste identificerede IgM'er stadig undetermined herunder den menneskelige remyelinisering-fremmende antistof rHIgM22, i øjeblikket i kliniske fase I forsøg for MS-patienter 11. Trods gentagne bestræbelser fra eksperter på området af lipid og kulhydrat forskning både i akademisk miljø og i partnerskab med industrien 11, forsøger at identificere rHIgM22 s antigen har ikke været en succes. Den manglende af standard teknikker, der anvendes til at identificere antigener af IgG antistoffer til at arbejde med IgM-antistoffer identificerer et kritisk behov for at forfine metoder er specifikke for disse antistoffer at de fleste sandsynligvis mål kulhydrat eller lipid antigener.
Fokus i dette manuskript er den menneskelige regenerativ antistof HIgM12 og de eksperimentelle procedurer, der anvendes til at identificere sin antigen. Antistof HIgM12 blev identificeret fra patienter med Waldenströms makroglobulinæmi, stimulerer neuritudvækst in vitro 12-14 og henvender polysialic syre (PSA) er fastgjort til den neurale celleadhæsionsmolekyle (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 forlænger levetid i en musemodel af ALS 17 og forbedrer funktionelt udfald i Theiler s murine encephalomyelitis virus (TMEV) -inficerede mus. Konkret HIgM12 stimulerer spontan horisontal og vertikal motorisk aktivitet i kronisk demyeliniserede mus og øger antallet af små og mellemstore diameter rygmarv axoner otte uger efter en enkelt, lav dosis af intraperitoneal injicerede antistof 18.
Det neurale celleadhæsionsmolekyle (NCAM) er et glycoprotein af immunglobulin (Ig) superfamilien udtrykkes på celleoverfladen af neuroner, glia, skeletmuskel, og naturlige dræberceller 19-25. De tre store NCAM isoformer betegnes NCAM180, NCAM140, og NCAM120, er alternative splejsning varianter af en primær afskrift, der varierer kun i deres cytoplasmatiske domæne. I CNS, NCAM er den største polysialylated molekyle (> 95%) med lange, negativt ladede sialinsyrereceptorer homopolymerer. Polysialic encid med n> 10 betegnes PSA men findes kortere oligomere strukturer, der også er biologisk relevant. Andre polysialylated proteiner udtrykt i CNS er SynCAM1 26, neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 og en natriumkanal-subunit 25 (for en oversigt se 29).
De her beskrevne metoder tillader antigen identifikation for humane og murine immunglobuliner indeholder bestemte kappa (VK) lette kæder (VκI, VκIII eller VκIV lette kæder for humane antistoffer og VκI lette kæder til muse-antistoffer) uanset antistof isotype (fx IgG, IgM , IgA, IgD eller IgE). Denne begrænsning er baseret på anvendelse af protein L-agarose for immunfældninger med antistoffer af IgM-isotypen. Alternative strategier kan omfatte mannose-bindende lectiner og sekundære IgG-anti-IgM-antistoffer kovalent bundet til agaroseperler, som kan udvide anvendeligheden af denne fremgangsmåde til flere IgM-antistoffer including dem med lambda (λ) lette kæder (se diskussionen). Forhold mellem serum IgM VK lette kæder sammenlignet med IgM λ lette kæder afledt fra raske personer er 1,5: 1 30.
Baseret på den kromatografiske metode bruges her til at adskille, berige og immunologisk påviser visse molekyler 31, er alle antigener skal omfatte mindst én lille proteindomæne. Antistoffets specifikke binding epitop kan være inden for eller uden for proteinet domæne (f.eks, i glycoproteiner, lipoproteiner). Indledende biokemiske trin, der anvendes til at identificere det specifikke antigen til HIgM12, respektive at indsnævre listen over potentielle kandidater, er de mest afgørende skridt i denne metode. Cell typespecifikke præparater og cellemorfologi-baserede karakteriseringer er beskrevet for gliaceller, men denne metode kan ekstrapoleres til at rumme andre celletyper inden for eller uden for CNS.
Der er et presserendenødt til at udvikle nye eller ændrede teknikker, der gælder for det stigende antal IgM-antistoffer med terapeutisk potentiale for forskellige menneskelige lidelser især i de tilfælde (de fleste af IgM antigener), hvor antistof mål er kulhydrat eller lipid strukturer.
Humane naturlige IgM-autoantistoffer er tiltalende kandidater til immunoterapi og har vist terapeutisk potentiale til behandling af forskellige sygdomme, herunder cancer og CNS-lidelser 1-7. Fordelagtigt vil disse antistoffer ikke fremkalde et immunrespons, hvor frembringelsen af neutraliserende antistoffer reducerer den effektive terapeutiske dosis og effekt væsentligt. Vigtigere, har alle antistoffer med terapeutisk potentiale været af den IgM isotypen og tilhører NAB repertoire 3-5,8,9,37,40,42-45. En væsentlig forhindring for den potentielle kliniske anvendelse af IgM-antistoffer er identifikationen af deres antigener, som er ubestemt i mange tilfælde. Standardteknikker anvendes til IgG antistoffer er ofte ikke umiddelbart at identificere et IgM s antigen.
Denne protokol beskriver identifikation af PSA-NCAM som antigen for regenerativ humant IgM-antistof HIgM12, effektive i dyremodellerMS og ALS 15-18. Den anvendte metode er primært gældende for alle humane antistoffer med specifikke VK lette kæder VκI, VκIII og VκIV og mus antistoffer med VκI lette kæder, uanset antistof isotype.
Det mest kritiske trin i denne protokol er anvendelsen af IgM-antistoffer i kromatografiapplikationer affinitet. Mere specifikt er succesfulde antistoffer skal fungere som pull-down midler i immunoudfældninger at isolere eller at berige et antigen ud af komplekse vævs- eller celle-kultur lysater. Berigede antigen fraktioner kan sammenlignes med immunopræcipitation isotypekontrolantistoffer og efterfølgende analyseret for forskelle ved massespektrometri. Et væsentligt krav eller begrænsning af dette trin er det tilstedeværelsen af det korrekte antistof VK let kæde og vært (menneske, mus) for at muliggøre antistofbinding til protein L-agarose. Anvendelse af mannan-bindende protein bundet til agarose (også called mannose-bindende lectin) i stedet for protein L-agarose er et potentielt alternativ til immunpræcipitere IgM'er uden specifikke VK lette kæder. Men som nævnt af Arnold et al. 35, antigen-bundne IgM-antistoffer ikke binder til mannan-bindende protein, som target glycan synes at blive utilgængelige, når IgM har bundet til dets antigen. Baseret på disse resultater mannan-bindende protein kan ikke bruges som en bindende matrix til at immunpræcipitere antigen-loaded IgM-molekyler 35. Andre potentielle alternativer kan skyldes anvendelsen af sekundære agarose-bundet anti-IgM IgG-antistoffer 46,47 eller brug af overfladeaktive aktiverede magnetiske perler 48. IgG antistoffer rettet mod IgM'er kunne være kemisk tværbundet til agarose A eller agarose G for at reducere omfanget af elueret antistof sammen med antigenet af interesse. En ordentlig sammenligning mellem forskellige varianter af IgM immunopræcipitation med hensyn til succes identificerede antigener is vanskeligt, fordi de fleste immunopræcipitationer blev udført for at isolere eller nedbryder IgM'er uden yderligere interesse i deres antigener. Desuden blev immunopræcipitationer ved hjælp IgM'er hovedsageligt anvendt til at bekræfte en allerede kendte eller forventede enkelt antigen med antistof udsættelse for oprensede antigener 49. En ulempe ved agarose-koblede IgG'er rettet mod humant IgM'er er et meget lavt udbytte (10 – 15%) af immunopræcipiteret serum IgM-molekyler sammenlignet med udgangsmaterialet 50. I modsætning hertil blev overfladeaktive aktiveret magnetiske perler udmærket anvendes på antistoffer af forskellige isotyper, herunder IgM at immunpræcipitere scrapie-associerede fibriller 48. Denne metode er ikke begrænset til specifikke kappa (VK) eller lambda (λ) kæder eller en bestemt vært, og kan i det væsentlige udvide spektret af IgM-antistoffer anvendes i immunfældninger.
Et andet vigtigt skridt i protokollen er antistoffet evne til at fungere som en itecting antistof (primært antistof) i Western blots eller andre screening platforme. Succesfulde antistoffer skal målrette deres antigen med tilstrækkelig høj affinitet til at tillade antigen binding i nærvær af ikke-ioniske eller eventuelt ioniske detergenter. Højaffinitetsantistoffer er udbredt blandt affinitets-modnet IgG-antistoffer, men mindre udbredt blandt antistoffer af IgM-isotypen, som er en af grundene til, at der er relativt få kommercielt tilgængelige IgM antistoffer som detektering midler i biokemiske indstillinger. Højaffinitetsbinding af antistoffer er et krav for immunopræcipitationer af molekylære antigener og for Western blotting. Sænkning vaskemiddel koncentrationer eller den fuldstændige mangel på detergenter i IP buffere og lysis buffere tillader antigen målretning af lav-affinitet antistoffer via sit Fab domæne. I modsætning hertil er antistoffets evne til at målrette protein L-agarose via dets Fc-del ikke påvirket væsentligt blandt isotypekontroller over et område af forskellige detergent koncentioner. Men koncentrationen lav rengøringsmiddel i lysisbuffer og IP buffer forhindrer cellemembranen forstyrrelser og isolering af specifikke molekyler. Tilsvarende vil en lav koncentration detergent i Western blot vaskebuffere (f.eks PBS-T) muliggør antigenbinding af lav-affinitet-antistoffer, men på samme tid øger ikke-specifik binding og derfor ikke en mulighed.
Tilstedeværelsen af et antigen-protein kerne er et andet krav til denne metode. Proteiner med posttranslationelle modifikationer (f.eks glycoproteiner, lipoproteiner) og umodificerede proteiner, men ikke eneste lipider eller carbohydrater, kan påvises i Western blots. Det er ikke muligt at immunpræcipitere lipider (f.eks sphingolipider) fra væv eller cellelysater i nærvær eller fravær af detergenter. De fysisk-kemiske egenskaber af detergenter og lipider er for ens til at tillade selektiv lipid-antistof-interaktioner, mens på samme tid detergenter er afgørende for at forstyrremembraner med henblik på at tillade selektiv isolering af specifikke molekyler. Til vores bedste viden, immunbundfældninger udelukkende består af kulhydrater, i mangel af et protein kerne, ikke tidligere er blevet rapporteret. Dette bliver især relevant, fordi IgM-antistoffer ofte målrette kulhydrater og glycolipider, som ikke nødvendigvis er knyttet til et protein enhed. Andre chromatografiske metoder er nødvendige for separation og immunologisk identifikation af lipider og kulhydrater i fravær af et protein kerne. For eksempel kan tyndtlagskromatografi (TLC) af cellulære lipider med efterfølgende antistofpåvisning på TLC-pladen (immuno-TLC) gennemføres 51,52.
Andre anti-PSA-antistoffer er blevet beskrevet i tidligere undersøgelser og resultater i forhold til HIgM12 samt det kommercielt tilgængelige anti-PSA IgM (klon 2-2b). Den mest almindeligt anvendte antistof på PSA er et IgG-antistof (klon 735) tilgængelig som muse monoclonal eller kanin polyklonalt antistof 53. Denne anti-PSA IgG-antistof detekterer PSA på SynCAM og NCAM på forskellige CNS-celletyper, herunder mikrogliaceller 41. I modsætning til anti-PSA IgG-antistof, humane IgM-antistoffer HIgM12, HIgM42 og anti-PSA muse-IgM (klon 2-2b) er ude af stand til at målrette PSA på SynCAM (men på NCAM) ved forskellige embryonale og tidlige postnatale faser i mus , mens ikke-polysialylated SynCAM er let detekterbar 15. De IgM-antistoffer anvendes, er heller ikke i stand til at detektere PSA på mikrogliaceller (figur 3 + 4). En mulig forklaring på forskelle observeret mellem antistofisotyper kan være lav PSA-SynCAM niveau sammenlignet med niveauer af PSA-NCAM kombineret med potentielt lavere affinitet binding af IgM-antistoffer i forhold til den anti-PSA IgG. For at teste denne hypotese, vi udførte immunopræcipitationer i NCAM KO dyr på fosterstadiet E17 med enorme mængder af SynCAM nuværende og brugte HIgM12 som en "pull-down agent" <sup> 15. I E17 WT kuld styrer HIgM12 immunopræcipiteret PSA-NCAM i et omfang, viste lignende intensiteter af "trukket ned" PSA-NCAM sammenlignet med IgM'er tunge kæde som detekteret ved densitometri i efterfølgende Western blot under anvendelse eluerede antigener. Dette resultat foreslog mindst en tilstrækkelig affinitet HIgM12 til sit mål PSA. I modsætning til WT kuldsøster styrer HIgM12 ikke afsløre PSA tilknyttet SynCAM i NCAM KO dyr. Identiske resultater blev opnået i immunopræcipitationer anvendelse af den humane anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 og HIgM42, samt muse-anti-PSA IgM (klon 2-2b) var ude af stand til at målrette PSA på SynCAM i Western blots fra WT og NCAM KO dyr ved embryonale og postnatale udviklingsstadier. I betragtning af den lave mængde HIgM12 påkrævet (0,1 ug / ml) til specifikt at detektere PSA bundet til NCAM i Western blots under anvendelse af små mængder af CNS-væv (0,1 ug CNS væv pr brønd) 15 synes det at være usandsynligt, at lave affiniteter alene eransvarlig for fuldstændig mangel på PSA-SynCAM detektion ved HIgM12 i tre forskellige metoder.
Vi konkluderer, at der er betydelige forskelle mellem anti-PSA IgM antistoffer og ofte offentliggjorte anti-PSA IgG-antistof (klon 735). Det er ikke klart, hvorfor kommercielt tilgængelige anti-PSA IgM-antistoffer ikke blev brugt oftere i fortiden for at bekræfte resultater opnået med antiPSA IgG-antistof 735. Dette er særlig interessant, fordi HIgM12 allerede har vist effekt i forskellige sygdomsmodeller. Mens andre anti-PSA IgM-antistoffer kan have lignende terapeutiske virkninger er det fortsat uklart, om anti-PSA IgG-antistof (klon 735) har en lignende terapeutisk resultat i modeller for MS og ALS.
Kort fortalt, blev fremgangsmåderne beskrevet her anvendes primært til at identificere antigen af regenerative humane antistof HIgM12 at støtte potentielle kliniske forsøg for MS og muligvis andre neurodegenerative sygdomme. Identifikationen af antigens for antistoffer med biologisk aktivitet er så vigtigt skridt for at forstå deres virkningsmekanisme. Dette bliver særlig relevant i forbindelse med en lang række monoklonale antistoffer i øjeblikket testet for sikkerhed og effekt i humane forsøg. Mens antallet af klinisk testede IgM-antistoffer til dato er lille, seneste fremskridt inden hybridomteknologi sammen med et stigende antal undersøgelser, der fremhæver det terapeutiske potentiale af denne antistofklasse 1-10,37,40,42-45 opfordrer udvikling af nye eller modificerede metoder gælder at identificere ikke-protein-IgM-antigener.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 og R21 NS073684), National Science Foundation (KARRIERE Award), Minnesota Partnerskab Award for Bioteknologi og Medicinsk Genomics, National Scleroseforeningen (CA1060A) og Mayo Clinic center for Klinisk og Translational Science (CCaTS). Forfatterne anerkender støtte fra Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Fonde, Månen og Marilyn Park Ledelseshverv Fund og McNeilus familien.
DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/mL, 100 ml |
N-2 Supplement (100X) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
B-27 Supplement (50X) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
STERILE WATER FOR IRRIGATION | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1000 ml, 12/CA |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein, |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein |
Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa |
Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
75cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
XT sample buffer (Western blot) | Biorad | #1610791 | 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer |
2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg |
25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm |
HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1M |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |