Fuldt automatiseret Centrifugal mikrofluidanordning for Ultrasensitive Protein Detection fra fuldblod
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
Flere platforme til sygdomsdiagnose er blevet udviklet baseret på nanoskala materialer 1,2 såsom nanotråde, 3 nanopartikler, 4 nanorør, 5 og nanofibre (NFS) 6-8. Disse nanomaterialer tilbyder fremragende udsigter i udformningen af nye teknologier til meget følsomme bioassays grund af deres unikke fysisk-kemiske egenskaber. For eksempel har mesoporøse zinkoxid nanofibre blevet anvendt til femto-molære sensitiv påvisning af brystkræft biomarkører. 9 nylig nanomaterialer på basis af titandioxid (TiO2) er blevet udforsket for bioanalytiske applikationer 10 tilgodese deres kemiske stabilitet, 11 ubetydelig proteindenaturering , 12 og biokompatibilitet. 13 Endvidere hydroxylgrupperne på overfladen af TiO2 lette kemisk modifikation og den kovalente binding af biomolekyler. 14,15 Mønstrede TiO2 thin film 16 eller TiO2 nanorør 17 er blevet anvendt til at forbedre påvisningen følsomhed et målprotein ved at øge overfladearealet; imidlertid fremstillingsprocessen er temmelig kompleks og kræver dyrt udstyr. På den anden side er elektrospundne forbund modtager opmærksomhed på grund af deres høje overfladeareal samt ligetil og billig fremstillingsproces, 18,19 endnu, den skrøbelige eller løse karakteristisk for elektrospundne TiO2 NF måtten gør det vanskeligt at håndtere og integrere med mikrovæskeanordninger. 6,20 Derfor blev TiO 2 NF måtter sjældent anvendes i bioanalytiske anvendelser, især dem, der kræver barske vaskebetingelser.
I denne undersøgelse for at overvinde disse begrænsninger har vi udviklet en ny teknologi til at overføre elektrospindes NF-måtter på overfladen af enhver mål-substratet ved anvendelse af en tynd polydimethylsiloxan (PDMS) klæbelag. Furthermore, har vi med succes viste integrationen af elektrospundne TiO2 NF-måtter på en centrifugal mikrofluidanordning af polycarbonat (PC). Ved anvendelse af denne anordning, var en høj-følsom, fuldautomatisk, og integreret påvisning af C-reaktivt protein (CRP) samt kardial troponin I (cTnI) opnås inden for 30 min fra kun 10 pi helblod. 21 På grund af den kombinerede fordele ved egenskaberne af NFS og den centrifugale platform, assayet udviste et bredt dynamikområde på seks størrelsesordener fra 1 pg / ml (~ 8 FM) til 100 ng / ml (~ 0,8 pm) med en nedre detektionsgrænse på 0,8 pg / ml (~ 6 FM) for CRP og et dynamisk område fra 10 pg / ml (~ 0,4 pm) til 100 ng / ml (~ 4 nm) med en detektionsgrænse på 37 pg / ml (~ 1,5 pm) for cTnI. Disse detektionsgrænser er ~ 300 og ~ 20 gange lavere sammenlignet med deres tilsvarende konventionelle ELISA-resultater. Denne teknik kunne anvendes til påvisning af eventuelle målproteiner med passende antistoffer. Samlet set denne enhed could i høj grad bidrage til in vitro-diagnostik og biokemiske analyser, da det kan detektere sjældne mængder af målproteiner med stor følsomhed selv fra meget små mængder af biologiske prøver, fx 10 pi fuldblod. Selvom vi kun demonstreret serumproteinet påvisning ved ELISA i denne undersøgelse, kan overførslen og integration teknologi af elektrospundet NF'er med mikrofluidenheder være mere udstrakt anvendelse i andre biokemiske reaktioner, som kræver et stort overfladeareal til høj detekteringsfølsomhed.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assayet på TiO2 NF integreret disk er en hurtig, billig og bekvem teknik til ultrasensitiv påvisning af lave rigelige proteiner til stede i meget lave blodvolumen. Denne teknik har den fordel at bruge små prøvevolumener (10 pi) og er modtagelig for analyse af flere prøver samtidigt. Dette tilvejebringer et stort potentiale som en multiplexing immunoassay enhed. Indretningen har den fordel, at det ikke kræver prøveforbehandling trin som plasma separation, som er nødvendige i konventionelle ELISA'er…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation Korea (NRF) tilskud (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), et tilskud fra den koreanske Health Technology R & D Project, Ministeriet for Sundhed og Velfærd (A121994) og IBS-R020-D1 finansieret af den koreanske regering.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
Referências
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -. J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. . SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).
- Tickoo, S. . EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
