تماما الجهاز الآلي الطرد المركزي ميكروفلويديك للكشف عن البروتين فائق الحساسية من الدم الكامل
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
وقد وضعت عدة برامج لتشخيص المرض استنادا إلى المواد النانومترية الحجم 1،2 مثل أسلاك، 3 النانوية، 4 الأنابيب النانوية و 5 و ألياف النانو (NFS) 6-8. هذه المواد النانوية آفاقا ممتازة في تصميم التقنيات الجديدة لاختبارات بيولوجية حساسة للغاية نظرا لخصائص الفيزيائية الفريدة. على سبيل المثال، تم استخدام ألياف النانو أكسيد الزنك mesoporous للفيمتو-الرحى كشف حساسة من المؤشرات الحيوية سرطان الثدي. 9 في الآونة الأخيرة، المواد متناهية الصغر على أساس ثاني أكسيد التيتانيوم (تيو 2) تم التنقيب فيها عن تطبيقات bioanalytical 10 النظر في الاستقرار الكيميائي، 11 يذكر تمسخ البروتين و 12 و توافق مع الحياة. 13 وبالإضافة إلى ذلك، فإن مجموعة الهيدروكسيل على سطح تيو 2 تسهل تعديل الكيميائية ومرفق التساهمية الجزيئات الحيوية. 14،15 منقوشة تيو 2 ثين الأفلام 16 أو تيو 2 نانوتيوب 17 استخدمت لتعزيز حساسية الكشف عن البروتين المستهدف من خلال زيادة مساحة السطح. ومع ذلك، فإن عملية تصنيع معقدة نوعا ما، وتتطلب معدات باهظة الثمن. من ناحية أخرى، NFS electrospun تحظى باهتمام بسبب مساحة عالية وكذلك عملية مباشرة وتلفيق تكلفة منخفضة؛ 18،19 بعد، فإن السمة الهشة أو فضفاضة من electrospun تيو 2 NF حصيرة يجعل من الصعب التعامل معها و تتكامل مع أجهزة ميكروفلويديك. 6،20 لذلك، نادرا ما تستخدم في تيو 2 NF الحصير في تطبيقات bioanalytical، ولا سيما تلك التي تتطلب الظروف القاسية الغسيل.
في هذه الدراسة، للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير تقنية جديدة لنقل electrospun NF الحصير على سطح أي الركيزة الهدف من خلال الاستفادة من طبقة لاصقة ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة (PDMS). Furthermore، لقد أظهرت بنجاح دمج electrospun تيو 2 NF الحصير على جهاز ميكروفلويديك الطرد المركزي المصنوعة من البولي (PC). باستخدام هذا الجهاز، تم التوصل إلى كشف عالية حساسة، مؤتمتة بالكامل، ومتكاملة من البروتين سي التفاعلي (CRP)، وكذلك التروبونين القلبي الأول (cTnI) في غضون 30 دقيقة من فقط 10 ميكرولتر من الدم الكامل. 21 نظرا لمجتمعة مزايا خصائص NFS ومنصة الطرد المركزي، أظهر فحص مجموعة واسعة ديناميكية من ستة أوامر من حجم من 1 غ / مل (~ 8 FM) إلى 100 نانوغرام / مل (~ 12:08) مع الحد الأدنى من الكشف 0.8 غ / مل (~ 6 FM) لCRP ومجموعة ديناميكية من 10 جزء من الغرام / مل (~ 12:04) إلى 100 نانوغرام / مل (~ 4 نانومتر) مع حد الكشف عن 37 جزء من الغرام / مل (~ 01:05) لcTnI. هذه الحدود هي كشف ~ 300 و~ 20 أضعاف أقل مقارنة نتائجها ELISA التقليدية المقابلة. ويمكن تطبيق هذه التقنية للكشف عن أي البروتينات المستهدفة، مع الأجسام المضادة المناسبة. عموما، هذا الجهاز المشتركيونيتبول تسهم إلى حد كبير في في المختبر تشخيص وفحوصات الكيمياء الحيوية نظرا لأنه يمكن الكشف عن كميات نادرة من البروتينات المستهدفة مع حساسية كبيرة حتى من كميات صغيرة جدا من العينات البيولوجية، على سبيل المثال، 10 ميكرولتر من الدم الكامل. على الرغم من أننا تظاهر فقط الكشف عن بروتين مصل باستخدام الاليزا في هذه الدراسة، ونقل ودمج التكنولوجيا من electrospun NFS مع أجهزة ميكروفلويديك يمكن تطبيقها على نطاق أوسع في التفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى التي تحتاج إلى مساحة كبيرة لحساسية الكشف عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفحص على تيو 2 NF قرص مدمج هي تقنية سريعة وغير مكلفة وسهلة للكشف عن فائق الحساسية من بروتينات وفيرة المنخفضة الحالية في حجم منخفض جدا من الدم. هذا الأسلوب له ميزة استخدام كميات عينة صغيرة (10 ميكرولتر)، وهي قابلة للتحليل عينات متعددة في وقت واحد. وهذا يوفر إمكانات …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث الوطني الكوري (جبهة الخلاص الوطني) منح (2013R1A2A2A05004314، 2012R1A1A2043747)، منحة من كوريا صحة التكنولوجيا R & مشروع التطوير، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (A121994) وIBS-R020-D1 بتمويل من الحكومة الكورية.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
Referências
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).
- Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).
- Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
- Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
- Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
- Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
- Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
- Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
- Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
- Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
- Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
- Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
- Kim, W. -. J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
- Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
- Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
- Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
- Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
- Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
- Lombard, M. . SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).
- Tickoo, S. . EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).
- Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
- Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
- Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).
