Summary

Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

Published: July 25, 2016
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Summary

Las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) representan una mejora marcada sobre el cultivo de células en entornos 2-D (por ejemplo, frascos o platos). Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana cultivadas en microgravedad proporcionada por la rotación de la pared de los vasos biorreactores (RWV).

Abstract

Dado que las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) tienen el potencial de salvar muchas lagunas de cultivo celular en ambientes 2-D (por ejemplo., Frascos o platos). De hecho, se reconoce ampliamente que las células cultivadas en frascos o platos tienden a DE-diferenciarse y perder características especializadas de los tejidos de los que se derivaron. Actualmente, existen principalmente dos tipos de sistemas de cultivo de 3-D, donde las células se sembraron en andamios que imitan la matriz nativa extracelular (ECM): (a) modelos estáticos y modelos (b) utilizando biorreactores. El primer gran avance fueron los modelos estáticos en 3-D. modelos en 3-D utilizando biorreactores como la pared de los vasos giratorio (RWV) biorreactores son un desarrollo más reciente. El concepto original de los biorreactores RWV fue desarrollado en el Centro Espacial Johnson de la NASA en la década de 1990 y se cree que superar las limitaciones de los modelos estáticos, tales como el desarrollo de hipoxia, núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir THes problema proporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y el oxígeno. Estos biorreactores constan de una base rotador que sirve para soportar y rotar dos formatos diferentes de recipientes de cultivo que se diferencian por su tipo de fuente de aireación: (1) Slow giro Los buques laterales (STLVs) con un oxigenador de co-axial en el centro, o (2 ) Los buques de alta Relación de aspecto (HARVs) con la oxigenación a través de una membrana de transferencia de gas de caucho de silicona plana. Estos recipientes permiten la transferencia de gas eficiente, evitando la formación de burbujas y la consiguiente turbulencia. Estas condiciones resultan en el flujo laminar y la fuerza de corte mínima que los modelos de gravedad reducida (microgravedad) en el interior del recipiente de cultivo. Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivadas en microgravedad proporcionada por el biorreactor RWV. </ P>

Introduction

El primer gran avance en la construcción de un modelo 3-D se informó a principios de la década de 1980 cuando los científicos empezaron a investigar los diferentes tipos de andamio (por ejemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV y fibronectina) y cócteles de factores de crecimiento para mejorar célula a célula y ECM interacciones de modelos en 3-D "estáticos" 1-7. Desde entonces, el principal problema de estos modelos ha sido limitaciones en la transferencia de nutrientes y oxígeno dentro de las construcciones medianas y tejidos 8. En contraste con las células en el entorno in vivo que recibe un flujo constante de nutrientes y el oxígeno de los alrededores de las redes de los vasos sanguíneos, la naturaleza estática de estos modelos dificulta la distribución efectiva de ellos a las células. Por ejemplo, los agregados de células generadas en modelos estáticos in vitro que superan unos pocos milímetros de tamaño invariablemente desarrollar hipoxia, 9 núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir este problemaproporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y 10-12 oxígeno. Sin embargo, hasta la fecha, el trabajo usando biorreactores RWV se han limitado a la inclusión de uno o dos tipos de células 13-17. Además, en lugar de una orientación espacial similar a tejidos nativos, las células forman agregados celulares. La razón principal de estas limitaciones ha sido la falta de un andamio capaz de incorporar las células de una manera integrada. Los andamios utilizados en los biorreactores RWV hasta la fecha consisten, con pocas excepciones, 16-18, sobre todo de microperlas sintéticas, cilindros tubulares o pequeñas hojas 13-15,19-23. Estos son materiales rígidos cuya composición y de flexibilidad no puede ser manipulado, y para el cual las células están unidas a su superficie. Por lo tanto, es poco probable que estos modelos proporcionar un sistema en el que evaluar, de una manera integrada, los diversos componentes celulares tales como las células del estroma (por ejemplo., Fibroblastos, células inmunes y endoteliales) que should dispersarse dentro del andamiaje para imitar el tejido humano.

Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales, fibroblastos y 24. Estas células se cultivaron en condiciones de microgravedad proporcionar por el biorreactor RWV 13,25-30. En nuestro modelo de 3-D, el ECM posee muchas propiedades distintas, tales como una osmolalidad similar al medio de cultivo (por ejemplo., Las restricciones de difusión despreciables durante el cultivo) y la capacidad de incorporar las células y otras proteínas de la matriz extracelular pertinentes, así como la rigidez apropiado para ser utilizado en los biorreactores de 24. Los sistemas biológicos son muy complejas, y en los últimos años, ha habido un cambio en el foco de la investigación de la mucosa hacia el examen de las interacciones de las células con su entorno en lugar de estudiar en isolationorte. En particular, la importancia de las interacciones célula-célula para influir en la supervivencia celular y la diferenciación intestinal está bien documentada 31-34. En concreto, la comunicación entre las células epiteliales y su nicho tiene una profunda influencia en la expansión de las células epiteliales y la diferenciación 35. De hecho, es ampliamente aceptado que no sólo de célula a célula, pero también las interacciones célula-ECM son críticos para el mantenimiento y la diferenciación de las células epiteliales en modelos de cultivo de 3-D. Estudios previos han demostrado que las proteínas ECM intestino tales como el colágeno I 24,36,37, laminina y fibronectina 38 39 son instrumentales para influir en las células epiteliales intestinales para adquirir la orientación espacial similar a la mucosa nativo. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas tecnologías, como nuestro modelo en 3-D 24, que puede imitar es necesaria la diversidad fenotípica del intestino si los investigadores tienen la intención de recrear la arquitectura celular y estructural complejay la función del microambiente intestino. Estos modelos representan una herramienta importante en el desarrollo y evaluación de nuevos fármacos orales y candidatos vacunales.

Protocol

Declaración de la ética: Todas las muestras de sangre se obtuvieron de voluntarios que participaron en número de protocolo HP-00040025-1. La Universidad de Maryland Junta de Revisión Institucional aprobado este protocolo y autoriza la recogida de muestras de sangre de voluntarios sanos para los estudios incluidos en este manuscrito. El propósito de este estudio fue explicado a los voluntarios, y todos los voluntarios dieron su, firmado el consentimiento antes de la extracción de sangre. Nota: Véase la <strong…

Representative Results

Anteriormente hemos diseñado un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivados en condiciones de microgravedad 24 (Figura 1). Los fibroblastos y las células endoteliales fueron incorporados en una matriz de colágeno I enriquecido con proteínas de la membrana basal intestino adicional 45<…

Discussion

En este manuscrito, se describe el desarrollo de un modelo de bioingeniería de la mucosa intestinal humana compuesta de tipos de células incluyendo linfocitos múltiplos primarios humanos, fibroblastos y células endoteliales, así como líneas de células epiteliales intestinales 24. En este modelo 3-D, las células se cultivaron dentro de una matriz extracelular rica en colágeno en condiciones de microgravedad 24.

Como se ha descrito anteriormente, las característ…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

Materials

Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
Endothelin 3 Sigma E9137
Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
Adenine Sigma A2786
Insulin Sigma I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
Cholera Toxin Sigma C-8052
Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
apo-Transferrin Sigma T-1147
Heparin Sigma H3149
Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
Gentamicin  Invitrogen 15750-060
Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Hepes Invitrogen 15630-080
Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

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Citar este artigo
Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

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