三次元(3-D)環境中で増殖する細胞は、2-D環境( 例えば 、フラスコまたはディッシュ)で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器(RWV)バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。
三次元(3-D)環境中で増殖する細胞は、多数の2次元環境における細胞培養の隙間( 例えば 、フラスコまたはディッシュ)をブリッジする可能性があるからです。実際には、広くフラスコまたはディッシュで増殖した細胞は、脱分化し、それらが由来する組織の特殊な機能を失う傾向があることが認識されます。 (a)は、静的モデルとバイオリアクターを用いて(b)のモデル:現在、天然の細胞外マトリックス(ECM)を模倣する細胞が足場に播種される3-D培養系の2種類が主に存在します。最初のブレークスルーは、静的な3次元モデルでした。このような回転-壁容器(RWV)バイオリアクターなどのバイオリアクターを用いた3次元モデルは、より最近開発されています。 RWVバイオリアクターのオリジナルのコンセプトは、1990年代初頭にNASAのジョンソン宇宙センターで開発された、そのような低酸素性、壊死性コアの開発のような静的なモデルの限界を克服すると考えられています。 RWVバイオリアクターは、番目のを回避する可能性があります栄養と酸素の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって、問題です。これらのバイオリアクターは、彼らの曝気源の種類によって異なる培養容器の二つの異なるフォーマットをサポートし、回転させるのに役立つローテータベースで構成されています。中心部に同軸人工肺で(1)スローターニング横船舶(STLVsを)、または(2フラット、シリコーンゴムガス転写膜を介して酸素との)高アスペクト比の船舶(HARVs)。バブル形成とその結果としての乱流を回避しながら、これらの血管は、効率的なガス移動を可能にします。これらの条件は、モデルは、培養容器内部の重力(重力)を低減し、層流と最小限のせん断力が生じます。ここでは、RWVバイオリアクターが提供する腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力下で培養内皮細胞および線維芽細胞から成るヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。</ P>
改善するために、最初の3-Dモデルを構築する画期的な科学者は、足場の異なるタイプの調査を開始したときに、1980年代の初頭に報告された( 例えば 、ラミニン、コラーゲンタイプI、コラーゲンIV、およびフィブロネクチン)および成長因子のカクテル「静的」3次元モデル1-7の細胞と細胞とECMの相互作用。それ以来、これらのモデルの主な問題点は、媒体および組織の構築8内の栄養と酸素の転送の制限となっています。血管のネットワークを周囲から栄養と酸素の定常流を受ける生体内環境での細胞とは対照的に、これらのモデルの静的な性質は、細胞へのそれらの効果的な分散を妨げます。例えば、 インビトロで生成された細胞凝集体のサイズは数ミリを超える静的モデルは常に低酸素性、壊死性コア9を開発します。 RWVバイオリアクターは、この問題を回避する可能性があります栄養素および酸素10〜12の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって。しかし、今日まで、RWVバイオリアクターを使用して作業は、1つまたは2つの細胞型13〜17を含むことに限定されています。また、代わりにネイティブの組織に似た空間的配向の、それらの細胞は、細胞凝集体を形成しました。これらの制限の主な理由は、一元的に細胞を組み込むことができる足場の欠如となっています。現在までにRWVバイオリアクターで使用される足場は、主に合成マイクロビーズ、チューブ状の円筒又は小シート13-15,19-23のいくつかの例外を除い16-18、で、構成されています。これらは、その組成や柔軟性に操作することができず、その細胞がその表面に結合して硬い材料です。したがって、一体的に、そのようなことだ間質細胞( 例えば 、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞)のような種々の細胞成分、これらのモデルを評価するには、システムを提供するとは考えにくいですhouldは密接にヒト組織を模倣するために、足場内に分散します。
ここでは、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、内皮細胞からなるヒト腸粘膜の多3次元器官型モデルの開発について説明し、線維芽細胞24。これらの細胞は、RWVバイオリアクター13,25-30によって提供微小重力下で培養しました。我々の3-Dモデルでは、ECM( 例えば 、培養中に、無視できる拡散拘束)は、培地に類似オスモル濃度などの多くの異なる特性を有し、細胞および他の関連する細胞外マトリックスタンパク質を取り込む能力、ならびにバイオリアクター24において使用される適切な剛性。生物学的システムは非常に複雑であり、過去数年間、isolatioでそれらを勉強するのではなく、その周囲との細胞の相互作用の検討に向けて粘膜研究の焦点のずれがありましたn個。具体的には、腸細胞の生存および分化に影響を与えるで細胞-細胞相互作用の重要性はよく31-34に記載されています。具体的には、上皮細胞とそのニッチとの間の通信は、上皮細胞の増殖と分化35に多大な影響を与えています。実際、それは広く受け入れられていることだけでなく、細胞間だけでなく、細胞 – ECM相互作用が3次元培養モデルにおける上皮細胞の維持および分化に重要です。以前の研究は、コラーゲンI 24,36,37、ラミニン38およびフィブロネクチン39は、ネイティブの粘膜に似た空間的配向を獲得するために腸上皮細胞に影響を与えることに尽力しているとして、その腸のECMタンパク質を実証しました。したがって、腸の表現型の多様性を模倣することができ、当社の3次元モデル24、のような新しい技術の開発が必要とされている研究者は、複雑な細胞及び構造のアーキテクチャを再作成する場合および腸の微小環境の機能。これらのモデルは、新しい経口薬やワクチン候補の開発および評価における重要なツールを表します。
本稿では、一次ヒトリンパ球、線維芽細胞、および内皮細胞、ならびに腸上皮細胞株24を含む倍数細胞型から成る、ヒト腸粘膜の生物工学モデルの開発を記載します。この3次元モデルでは、細胞は、微小重力条件下24の下で、コラーゲンが豊富な細胞外マトリックス内で培養されます。
前述したように、このモデルの主な特徴は次の通りである:(…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Insulin | Sigma | I-6634 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |