조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)는 아직 작은 일부 내피 세포는 혈액이 형성되기 위해 지정하는 과정에 대해 알려진, 개발 과정에서 전문 (hemogenic) 내피 세포에서 파생. 우리는 뮤린 배아 조직으로부터 hemogenic 내피 세포 HSPC 동시에 아이솔레이션을 허용하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 보여준다.
배아 혈관 내피 세포에서 hemogenic 내피 세포의 사양은 별개의 조직 내에서 짧은 개발 기간 동안 발생하며, (쥐 여분의 배아 난황, 태반, 제대 혈관 및 배아 대동맥 – 생식선 – mesonephros에서 최종 HSPC의 출현에 필요한 AGM) 지역. 이 세포 인구의 일시적인 자연과 작은 크기주의 정량 및 실험 응용 프로그램에 대한 재현 분리가 기술적으로 어려운 렌더링합니다. 우리는 난황과 AGM에서의 피크 발생 시간 동안 hemogenic 내피 세포와 HSPC의 동시 분리를위한 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 기반의 프로토콜을 설립했다. 우리는 난황 및 마우스 배아에서 AGM 조직의 절개하는 방법을 보여, 우리는 사전 FACS를 통해 식별 및 검색에 최대한의 세포 생존에 최적화 된 조직 소화와 항체 결합 조건을 제시한다. 대표 FACS 아나용해 플롯은이 hemogenic 내피 세포와 HSPC의 표현형을 식별하고, 클론 수준에 혈액 형성 가능성을 평가하기위한 메틸 셀룰로오스 기반의 분석을 설명 표시됩니다.
기능성 순환계 혈관 및 혈액 세포의 병렬 개발을 필요로한다. 혈액 개발 (원시 조혈)의 초기 단계에서, 적혈구 모세포의 기원은 적극적으로 일을 토론 상태를 유지합니다. 반면, 혈액 세포 개발 (최종 조혈)의 나중 단계에서, 그것은 멀티 혈통 HSPC 전문 혈관 내피 난황, 태반 내 혈액 형성 가능성 (hemogenic 내피 세포)를 취득 세포 및 AGM에서 발생하는 것이 점점 명백 해졌다 2-5뿐만 아니라 난황 제대 혈관 내막 배아 6, 헤드 혈관 7인치 이러한 별개 조직 내의 내피 세포 hemogenic의 명세는 개발의 특정 단계에서 발생; 예를 들어, ~ E8.25에서 난황 내와 ~ E10 8-12에서 AGM 내. hemogenic 엔도의 그럼에도하더라도 이들 특정 발달 윈도우 동안 인구11, 12 – (난황과 AGM 내피 세포의 3 % 1) 상피 세포는 모든 내피 세포의 작은 부분을 나타냅니다. hemogenic 내피 세포 "지정"프로세스는 물론, 인간 조혈 같은 뮤린 중요하다. 조혈 세포는 난황낭 혈관의 내피 세포와 인간 배아 (13)의 대동맥에서 새싹 것으로 나타났다, 여러 연구소는 인간 만능 줄기 세포에서 혈액 세포 생산이 14 ~ 16 중간 내피 세포 필요함을 증명하고있다. 따라서, 쥐 hemogenic 내피 세포의 표현형을 정의하고 인간 만능 줄기 세포에서 hemogenic 내피 세포의 생성을위한 시험 관내 기술의 추구를 촉진한다이 동물 모델에서의 개발로 이어질 분자 이벤트를 이해. 차례로, 다중 계통으로 분화 HSPC 혈액 세포 유형의 대규모 생산을위한 접근 방법의 최종 개발 – 자체 DERI중간 생리 관련 hemogenic 내피 세포를 통해 인간 만능 줄기 세포에서 VED는 – 혈액, 종양 학적 및 재생 의학에 대한 놀라운 치료 가능성을 가질 것이다. 이 목표를 향해, 우리는 배아 중 최종 HSPC 생산의 11 AGM (12), 두 가지 주요 사이트 주머니 쥐의 노른자 내에서, 클론 수준에, hemogenic 내피 세포의 표현형을 정의했습니다. 따라서 성인의 골수 (17), 배아 hemogenic 내피 세포와 HSPC 전시 훽스트 (Hoechst) 염료 유출 속성 내 HSPC와 마찬가지로 "쪽 인구"내 (그림 3)은 FACS 플롯 5,11,12에 세포 (SP)를 나타납니다. 또한, 우리는 또한 hemogenic 내피 세포가 모두 내피 세포의 마커를 표현하고 세포 (각각 Flk1 및 cKit를) 줄기 있지만, 조혈 계통 마커, CD45 5,11,12을 표현하지 않는 것으로 나타났습니다. 따라서, hemogenic 내피 세포는 답하라 될 수 있습니다ified하게하고 FACS에 의해 격리 Flk1 + / cKit + / CD45- SP 세포로서, 우리는이 세포가 난황과 AGM 세포 5,11,12의 Flk1- / cKit + / CD45 + SP 부분에 포함 HSPC을 야기 할 것으로 나타났습니다. Hemogenic 내피 세포와 HSPC하거나 (그림 1에 도시 된 바와 같이) 생체 배아 문화에 최대 48 시간 동안 배양 한 배아에서 확인 및 난황 또는 갓 안락사 배아 중 하나에서 수확 AGM 조직에서 분리 할 수 있습니다. 예 생체 내 문화는 선택적 허용 약리 에이전트와 개별 배아의 전처리, 또한 원하는 유전자 (즉, 렌티 바이러스 전달에 의해)의 일시적 발현 수 있습니다. 본원에 기재된 방법으로 hemogenic 내피 세포 HSPC의 FACS 식별을 유 전적으로 조작 된 마우스 모델에서 최종 조혈 개발 정량적 척도로서 사용될 수있다; 세포는 혈액 FO 포함한 후속 실험 애플리케이션에 검색 될 수있다rming 분석법 발현 분석 및 이식.
동물 주제 : 용도 및 윤리적 고려 사항
문학의 성장 몸은 배아 발달의 결정적인 조혈 단계에서 HSPC 형성에 hemogenic 내피 세포의 중요한 기여를 설립했다. 그러나하는 hemogenic 운명 향해 내피 세포의 아 집단의 사양을 촉진 생리적 조건 신호가 제대로 이해 유지하며, 따라서 아직 시험 관내 환경에서 모방 할 수 없다. 사실,이 문서에 설명 된 기술은 생체 hemogenic 내피 세포 사양 및 HSPC 생산을위한 접근 방식이 언젠가는 개발 될 수 있도록 hematovascular 개발 분야의 이해를 개선하기 위해 우리의 실험실과 다른 그룹에서 현재 사용합니다. 때까지, 그러나, 필드는 기본 야생형에서 조직 (유전자 의존 유지학적으로 변형 된) 마우스 배아는 추후 연구 hemogenic 내피 세포와 HSPC를 지정 구하십시오. Hemogenic 내피 세포와 HSPC 확실하게 식별하거나 E8.5에서 고립 될 수있다 (10-12 체절 쌍) 난황 또는 E10.5 (35-40 체절 쌍) 11, 12 AGM. 때문에 hemogenic 내피 세포의 상대적 부족에 (일반적으로 1 나타내는 – 총 내피 세포 이러한 조직 내에서 11, 12의 3 %) 여러에서 조직의 풀링 (~ 8-10) 하나의 샘플로 한배 새끼 강하게하기 위해 권장 후속 실험에 대한 충분한 세포를 얻을 수 있습니다. hemogenic 내피 세포 HSPC 성공적으로 식별되고 격리되었는지 검증 조혈 분화 유도 조건으로 검색 한 세포 배양에 의해 달성 될 수있다. 이러한 조건에서, 내피 세포 및 hemogenic HSPC는 ERY 함유 콜로니의 출현을 초래 다중 조혈 계통의 분화를 나타낼 것이다throid 전구 세포 (BFU-E), 과립구 대 식세포 전구 세포 (CFU-GM)와 과립구, 적혈구, 대 식세포, 거대 핵 세포의 전구 콜로니 (CFU-GEMM).
때문에 특정 발달 창 중에 만 등장 과도 작은 세포 집단을 연구에 내재 된 기술적 인 문제로 아직 초기 단계 필드 – hematovascular 개발 분야에서 많은 대답없는 질문이 남아있다. 위에서 설명한 기술은 심지어 싱글 hemogenic 내피 세포에서 세포와 일반적으로 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 시약 및 장비를 사용하여 중요한 발달 시점에서 배아 조직에서 HSPC 인구의 격리를 허용함으로써 이러한 어려움의 많은 개선. 우리의 프로토콜은 후속 분석에서 hemogenic 내피 세포의 일부분에 대한 제어를 독립적 인 분석을 위해 사용, 또는 할 수있는 YS와 AGM에서 비 hemogenic 내피 세포 분획의 병렬 분리 수 있습니다.
이 다색 FACS 기반 방법을 사용 hemogenic 내피 세포의 분리에 중요한 점은 적절한 스펙트럼 공동mpensation 및 단일 색상 게이트의 정확한 도면. 이와 같이, 강하게 염색과 단색 제어가 모든 실험 타점을 포함하는 것이 권장되며, 이들은 해당 – 함께 이소 정합 제어 항체로 처리 한 샘플 – 초기 적절한 스펙트럼 보상 게이트 도면을 확립하기 위해 사용될 수. 그러나, 비특이적 염색 따라서 염색 및 단색 컨트롤 FACS 분류기 설정이 최적화 된 후 게이트 확인 루틴을 충분이 프로토콜에 의해 최소화된다.
부정확하게 그려 SP 문이 보고서에 기술 된 방법과 특정 문제입니다. 이전의 연구는 다 능성 줄기 세포를 FACS로 SP의 모양에 대한 생리 학적 근거를 형성 훽스트 레드 17 우선적 유출을 나타내는 것을 보여 주었다. 우리는 hemogenic 내피 세포를 표시하고 HSPC 마찬가지로 SP 세포 분획 5,11에서 발견된다. 이러한 칼슘 채널 같은 약물hibitor 베라파밀은 트랜스 약제 내성 컨베이어의 다양한 방해물 통해 SP 셀이 훽스트 염료 유출 동작 블록. 조혈 줄기 및 전구 세포를, 이는 주로 ABCG2 / BCRP1 수송 체 (24)를 통해 발생한다. 일반적 베라파밀은 SP의> 50 %의 막힘을 유발하지만, 본 베라파밀 의해 훽스트 유출 전체적인 과정과 후속 막힘 아마도 인해 차동 훽스트 여러 다제 내성 트랜스 형의 발현의 변화에 발달시기 영향을받는 것으로 밝혀졌다 베라파밀 5 유출 능력과 감성. 따라서 강력 베라파밀 처리 것을 권장 훽스트 염색 음성 대조군 표준 적 적절한 SP 게이팅을 위해 포함될 일 : SP 게이트가 제대로 그려진 경우, SP 세포 수의 현저한 감소가에 훽스트 염색 표본에서 검출되어야 베라파밀의 존재.
우리는 이전에 보여 분류하는E9.5의 쥐의 난황에서 SP 세포가 ~ 80가 – E9.5 미분 획의 일치 수에 비해 메틸 셀룰로오스 기반의 조혈 문화에 HSPC를 생성하는 90 배 더 큰 능력을, 비 훽스트는 전체 YS의 조직 세포 5 스테인드. 은 SP의 또 다른 특성은 초기 조혈 및 E8.0에서 혈관 개발하는 동안 쥐의 난황에서 그것을 보여 주었다, VE-cadherin의 및 FLK-1의 뚜렷한 표현하지만, 줄기 (C-키트) 및 조혈 마커의 낮은 표현이 (CD45). 따라서, + / CD45- 비 SP 세포 우세 FLK-1 + / CD31로 정의이 발달 평가시기, 원시 (비 hemogenic) EC에서. 내피 세포 마커의 발현이 감소하고 CD45와 형 c-Kit 발현 증가, E9.5 및 E11.5 (5) 사이의 시험 관내 HSPC를 생성하는 능력이 증가 병용 등이 발현 프로파일 이행한다. 이 YS 조직의 조혈 활동이 E9.5과 E11.5 및 occurr 사이의 가장 명백한지고의 SP에 포함되어 제안내피 특성과 조혈 능력의 점진적 획득의 시간 초과 손실을 보내고. 이와 같이, SP 표현형을 야기주는 약제 내성 트랜스 포터의 발현이 내피 hemogenic 5의 중요한 표현형 마커이고; 사실, AGM에서 비 SP 세포는 혈액 형성 가능성 (12)를 나타내지 않는다. 따라서, YS와 AGM 모두 훽스트 염색 통해 SP 성공적 격리 (세포가 hemogenic의 차별을 허용이 분획 내의 특정 조직의 조혈 줄기 세포 구획과 세포의 후속 항체 염색에서 정렬되도록 FLK 보장 -1 + / C-키트 HSPC 대 + / CD45-) (Flk1- / C-키트 + / CD45 +) 인구 5,11,12. 또한, 이전 된 난황과 AGM 조직의 SP 내에서 CD41 + 세포가 메틸 셀룰로오스 기반의 문화 (11, 12)에 멀티 혈통의 콜로니 형성 할 수 있음을 지적하고있다. 우리는 Flk1 +의 형 c-Kit + CD45- SP 세포로 hemogenic 내피 세포를 정의조혈 계통의 지정된 마커로 CD45을 사용하기보다는 CD41 우리가 Flk1 및 CD45의 발현을 찾는 제공함으로써들 5,11 실질적으로 상호 배타적입니다. 이 두 내피가있는 SP 내에서 세포의 순수 분리 할 수 있습니다 (FLK-1) 및 조혈 전환에 내피에 필요한 특성 (C-키트) 줄기 그러나 이들의 CD45의 유무에 의해 결정되는 아직이 변경을 시행하지 않은 세포. 최근 고메즈와 동료들에 의해보고 된이 Csf1r + (조직 대 식세포) 및 Csf1r- (HSC) 부분에 FLK-1 / C-키트 + / CD45 + / SP 세포로 정의 HSPC 인구의 하위 분류를 고려하는 것이 유용 할 것이다 25 일이 조직의 대 식세포의 전구 인구 대비 실제 HSPC의 높은 해상도를 제공 할 것이다, 그러나 이것은 고립 우리가 Csf1r부터 설명했다 식세포 전구 세포 (26)의 마커 인 hemogenic 내피 세포 분획의 무결성에 영향을 미치지 않습니다있다.
Hemogenic 내피 세포는 YS와 (1 포함 – 내피 세포의 3 %) AGM 모두에서 드문 하위 집단이다, 따라서 그들의 연구의 주요 과제는 다음 응용 프로그램에 대한 불충분 한 세포 수율이다. 이 프로토콜은 일반적으로 10-20 %의 경우에도 최적의 조건에서 단지 몇 백 세포를 얻을 수있다 정렬의 시간 및 여러 배아에서 얻은 풀링 조직에서 전형적인 hemogenic 내피 세포의 종류에 의해 실행 가능한 나머지 셀 70 ~ 80 %가 결과 의 메틸 셀룰로오스 생산 식민지에 포함 된 셀을 검색. 조직이 빠르게 해부 및 풀링되어야하고, 샘플을 가능한 한 얼음에 보관해야합니다 : 정렬 된 세포의 수를 최대화하기 위해서는 강력 수사관이 절차의 모든 단계에 걸쳐 조직과 세포 생존을 보장하기 위해 조치를 취할 것을 권장합니다. 샘플은 직전 FACS 정렬에 신선한 준비 및 기술로 메틸 문화에 직접 높은 혈청 콘텐츠 또는를 포함 수집 튜브로 정렬되어야한다위 거라고. 생존의 문제가 지속되면, 수집 튜브는 더 정렬 된 세포 생존을 향상시키기 위해 혈청 미리 코팅 될 수있다. hemogenic 내피 세포의 수율을 낮게 유지하면, 성인 골수 또는 시판되는 형광 접합 된 비드를 본 명세서에 설명 된 배아 조직 유래 단색 제어 대신 스펙트럼 보정을 위해 사용될 수있다. 분류 세포를 배양하기위한 것입니다 경우, hemogenic 내피 세포 및 HSPC은 조직 배양 우물에 직접 정렬해야합니다. 정렬 세포가 DNA 또는 RNA 관련 유전자 발현 분석, hemogenic 비 hemogenic 내피 세포 HSPC위한 경우 세포의 손실을 최소화하기 위해 샘플 용해 완충액을 함유하는 수집 튜브에 직접적으로 정렬 될 수있다.
개설 된 기술 같은 태아 조직으로부터 성공적으로 (동시) hemogenic 비 hemogenic 내피 세포의 분리뿐만 아니라, HSPC 성숙한 혈액 세포 분획을 허용한다. 이 방법은 더 스터드 수 있습니다내피 세포는 혈액을 생성으로 발생하는 중요한 전환의 분자 토대의 Y. 이러한 연구 개발에서 얻은 통계는 능성 hemogenic에서 인간 내피 세포 및 HSPC 자손의 생성을 최적화 할 수 있으며, 잠재적으로자가 널리 알려진 조혈 장애의 치료에 줄기 세포를 수있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |