Mucine agarosegelelektroforese: Western blotting voor hoge molecuulgewicht glycoproteïnen
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Mucinen, de zwaar-geglycosyleerde eiwitten voering mucosale oppervlakken, hebben zich ontwikkeld als een belangrijk onderdeel van de aangeboren verdediging door het epitheel te beschermen tegen binnendringende ziekteverwekkers. De belangrijkste rol van deze macromoleculen is deeltje trapping en de klaring te vergemakkelijken terwijl het bevorderen van de smering van het slijmvlies. Tijdens eiwitsynthese, mucinen ondergaan intense O-glycosylatie en multimerisatie, die de massa en omvang van deze moleculen sterk te verhogen. Deze post-translationele modificaties zijn cruciaal voor de visco-elastische eigenschappen van mucus. Als gevolg van de complexe biochemische en biofysische eigenschappen van deze moleculen, samen met mucinen biedt vele uitdagingen die niet kan worden overwonnen door conventionele eiwit analysemethoden. Bijvoorbeeld hun hoge molecuulgewicht voorkomt elektroforetische migratie via gewone polyacrylamidegels en hun kleverige aard veroorzaakt adhesie experimentele tubing. Echter, onderzoeken de rol van mucinen in gezondheid(Bijv., Handhaven mucosale integriteit) en ziekte (bv., Hyperconcentration, mucostasis, kanker) onlangs verworven belang en mucinen worden onderzocht als een therapeutisch doelwit. Een beter begrip van de productie en functie van macromoleculen mucine kan leiden tot nieuwe farmaceutische benaderingen, bijvoorbeeld remmers van mucine granule exocytose en / of mucolytische middelen. Daarom, consistente en betrouwbare protocollen te onderzoeken mucine biologie zijn van cruciaal belang voor wetenschappelijke vooruitgang. We beschrijven conventionele methoden mucine macromoleculen scheiden door elektroforese met gebruik van agarose gel, overbrengen eiwit in nitrocellulose membraan en gedetecteerd signaal met mucine-specifieke antilichamen en infrarood fluorescerende gel lezer. Deze technieken zijn breed toepasbaar te bepalen mucine kwantificering, multimerisatie en om de effecten van farmacologische verbindingen op mucinen testen.
Introduction
Mucines worden gewoonlijk geproduceerd door mucosale oppervlakken die holten blootgesteld aan de buitenomgeving lijn (bijv., Ademhaling, spijsvertering, voortplantingsstelsel, oogoppervlak) en inwendige organen (bijvoorbeeld, pancreas, galblaas, borstklieren). De aanwezigheid van deze glycoproteïnen onderhoudt oppervlak hydratatie en vormt een fysieke barrière tegen ziekteverwekkers. Hoewel mucine productie essentieel voor de gezondheid mucosale, mucine hyperconcentration en / of afwijkende slijm eigenschappen kunnen leiden tot obstructie duct, bacteriële kolonisatie en chronische ontsteking, onomkeerbare weefselschade kan veroorzaken. Een vergelijkbare cascade van gebeurtenissen worden waargenomen in een aantal ziekten, bv., Cystic fibrosis 1, chronische otitis media 2 en cervicovaginal infectie 3. Daarom is het belangrijk om de rol van mucinen bij gezondheid en ziekte begrijpen en routine protocollen vast te stellen voor proteïne-identificatie.
Daten, 19 mucinen genen geïdentificeerd en coderen voor grote polypeptideketens die variëren van 1200 (bijv., MUC1) tot 22.000 (bijvoorbeeld MUC16) aminozuren. Het mucine genfamilie kan worden onderverdeeld in twee subtypen: de membraan geassocieerde mucinen, betrokken bij cel-signalering en de afscherming, en de gelvormende mucinen, verantwoordelijk voor de visco-elastische eigenschappen van mucus gels. Membraan-geassocieerde mucinen zijn meestal monomere en hechten aan het celoppervlak via een hydrofoob membraan omspannende domein. Daarentegen gelvormende mucinen hebben verschillende von Willebrand factor (vWF) -achtige en cysteïnerijke domeinen die essentieel zijn voor de vorming van dynamische polymère netwerken. Grote glycanen zijn aan serine en threonine residu verdeeld over het apomucin. Deze dichte O-gekoppelde Oligosacchariden kunnen oplopen tot 80% van het molecuulgewicht 4. Intra- en intermoleculaire disulfidebindingen verbinden mucine monomeren de integriteit van de mucine gel network. Door zware glycosylering en multimerisatie, mucinen tot de grootste moleculen in het dierenrijk en kan niet worden geanalyseerd met standaard gelelektroforese met gebruikelijke SDS-PAGE polyacrylamide gel en standaard eiwit ladders. Deze werkwijzen lossen / de eiwitten met molecuulgewichten lager dan 250 kDa, terwijl mucine monomeren kan oplopen tot 2 MDa bij MUC16. Echter, hoog molecuulgewicht eiwit ladders worden gebruikt om kleine mucine monomeren bestuderen (bijv., MUC1).
Verschillende technieken kunnen worden toegepast op mucine grootte, bouw en interactie te bestuderen. Traditioneel wordt biochemische karakterisering van mucinen bereikt door mucine-isolatie via isopycnische dichtheid-gradiënt centrifugeren in denaturerende buffer, gevolgd door grootte-uitsluitingschromatografie en immunodetectie (bijv., Slot blotting) 5. Dynamisch en / of multi-angle lichtverstrooiing informatie verstrekken over de oligomere toestand van mucine-rijke monsters <sup> 1. Bovendien zijn snelheid-zonale centrifugatie gekoppeld immunodetectie en transmissie elektronenmicroscopie gebruikte macromoleculaire conformatie van mucinen 6 bepalen. Massaspectrometrie wordt ook gebruikt om mucinen kwantificeren detecteren proteolytische splitsing en analyseren oligosaccharide samenstelling 1,7,8. Dergelijke technieken zijn duur, tijdrovend en vereisen vaak grote hoeveelheden en / of hoge concentraties van het monster. De werkwijze hierin beschreven, bijv., Mucine scheiding door elektroforese reproduceerbaar, goedkoop en kan worden gebruikt in high-throughput studies om relatieve kwantificering mucine geven en te onderzoeken chemische polymeren. Echter, deze test vereist een hoge affiniteit, hoge specificiteit mucine antilichamen die niet beschikbaar zijn voor zeldzame mucinen kunnen zijn (bijv., MUC19) of bepaalde soorten (bijv., Varken, fret).
Agarose Western blotting geschikt om allerlei mucine-rijke monsters met concentraties oplossenties die variëren van 50 ug / ml (bijv., cellen wast) tot 5 mg / ml (bijv., sputum). Deze test werd geïntroduceerd in de jaren 1990 en werd alleen uitgevoerd in enkele gespecialiseerde laboratoria 9,10. Aanvankelijk deze techniek hielp identificeren subpopulaties van mucine in menselijke monomeren sputum 11,12 en bevestigde het oligomerisatie proces slijmbekercellen, bestaande uit dimeervorming in het endoplasmatisch reticulum, gevolgd door dimeer multimerisatiedomein in het Golgi-apparaat 13. Meer recent, het genereren van polyklonale antilichamen tegen muizen mucinen vergemakkelijkt studies op kleine diermodellen (bv., Mucine tekort, βENaC, OVA-uitgedaagd muismodellen) en opende een nieuw onderzoeksgebied voor preklinische studies testen van farmacologische verbindingen die gericht zijn op het verwijderen van slijm uit de longen 14-17. Als gevolg van een toenemende belangstelling mucine biologie en het genereren van nieuwe, meer specifieke mucine antilichamen beschrijven we herein de methodologie mucinen gescheiden door agarose gelelektroforese, vacuümoverdracht naar nitrocellulose en twee-kleuren infrarood fluorescentiedetectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol van mucine Western blotting beschreven in deze video combineert conventionele technieken van moleculaire biologie gescheiden zijn en breng grote macromoleculen, zoals DNA, met regelmatige technieken voor eiwitdetectie, dwz., Immunoblotting. Dezelfde techniek kan worden toegepast op de biologie van complexe glycosaminoglycanen, zoals de afbraak van hoog molecuulgewicht hyaluronzuur 18 bestuderen. Hoewel deze techniek kan worden gebruikt in een groot aantal testen succesvolle agarose Weste…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Referências
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from ‘normal’ human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
