Mucin agarose जेल वैद्युतकणसंचलन: उच्च आणविक वजन Glycoproteins के लिए पश्चिमी सोख्ता
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Mucins, भारी-ग्लाइकोसिलेटेड श्लैष्मिक सतहों अस्तर प्रोटीन, हमलावर रोगजनकों के खिलाफ उपकला की रक्षा के द्वारा सहज रक्षा की एक प्रमुख घटक के रूप में विकसित किया है। इन अणुओं की मुख्य भूमिका है जबकि म्यूकोसा के स्नेहन को बढ़ावा देने के कण फँसाने और निकासी की सुविधा के लिए है। प्रोटीन संश्लेषण के दौरान, mucins तीव्र हे ग्लाइकोसिलेशन और multimerization, जो नाटकीय रूप से बड़े पैमाने पर और इन अणुओं के आकार में वृद्धि से गुजरना। ये बाद translational संशोधनों बलगम के viscoelastic गुणों के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन अणुओं की जटिल जैव रासायनिक और biophysical प्रकृति का एक परिणाम के रूप में, mucins के साथ काम करने में कई चुनौतियों है कि पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण के तरीकों से दूर नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अपने उच्च आणविक वजन नियमित रूप से polyacrylamide जैल के माध्यम से electrophoretic प्रवास को रोकता है और उनके चिपचिपा प्रकृति प्रयोगात्मक ट्यूबिंग के लिए आसंजन कारण बनता है। हालांकि, स्वास्थ्य में mucins की भूमिका की जांच(जैसे।, श्लैष्मिक अखंडता को बनाए रखने) और रोग (जैसे।, Hyperconcentration, mucostasis, कैंसर) ने हाल ही फायदा हुआ है और ब्याज mucins एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में जांच की जा रही है। उत्पादन और mucin अणुओं के समारोह के एक बेहतर समझ उपन्यास दवा दृष्टिकोण, जैसे, mucin दाना exocytosis और / या mucolytic एजेंटों के अवरोधकों को जन्म दे सकता है। इसलिए, सुसंगत और विश्वसनीय प्रोटोकॉल जांच करने के लिए जीव विज्ञान mucin वैज्ञानिक उन्नति के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहाँ, हम पारंपरिक विधियों का वर्णन एक agarose जेल का उपयोग वैद्युतकणसंचलन द्वारा mucin अणुओं को अलग, nitrocellulose झिल्ली में प्रोटीन हस्तांतरण, और mucin विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ संकेत के रूप में अच्छी तरह से अवरक्त फ्लोरोसेंट जेल पाठक पता लगाने के लिए। इन तकनीकों में mucin quantitation, multimerization निर्धारित करने के लिए और mucins पर औषधीय यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए व्यापक रूप से लागू कर रहे हैं।
Introduction
Mucins सामान्य रूप से श्लैष्मिक सतहों कि बाहरी वातावरण के संपर्क में गुहाओं लाइन द्वारा उत्पादित कर रहे हैं (जैसे।, श्वसन, पाचन, प्रजनन इलाकों, नेत्र सतह) के साथ ही आंतरिक अंगों (जैसे, अग्न्याशय, पित्ताशय की थैली, स्तन ग्रंथियों)। इन ग्लाइकोप्रोटीन की उपस्थिति सतह हाइड्रेशन का कहना है और रोगजनकों के खिलाफ एक शारीरिक बाधा रूपों। हालांकि mucin उत्पादन, स्वास्थ्य mucosal को mucin hyperconcentration और / या न्यायपालिका बलगम गुण वाहिनी बाधा, बैक्टीरियल उपनिवेशवाद और जीर्ण सूजन है, जो अपरिवर्तनीय ऊतकों को नुकसान का कारण बन सकते हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं आवश्यक है। घटनाओं की एक समान झरना, कई बीमारियों में मनाया जाता है जैसे।, सिस्टिक फाइब्रोसिस 1, पुरानी ओटिटिस मीडिया 2 और cervicovaginal संक्रमण 3। इसलिए, यह स्वास्थ्य और रोग में mucins की भूमिका को समझने के लिए और प्रोटीन की पहचान के लिए नियमित प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
तारीख तक19 mucins जीन 22,000 (जैसे, MUC16) अमीनो एसिड के लिए पहचान की गई है और बड़े पॉलीपेप्टाइड 1,200 से लेकर श्रृंखला के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना (जैसे।, MUC1)। mucin जीन परिवार के दो उप-प्रकारों में बांटा जा सकता है: झिल्ली जुड़े mucins, सेल संकेतन और सतह के परिरक्षण में शामिल है, और जेल के गठन mucins, बलगम जैल के viscoelastic गुणों के लिए जिम्मेदार है। झिल्ली जुड़े mucins ज्यादातर monomeric कर रहे हैं और एक हाइड्रोफोबिक झिल्ली फैले डोमेन के माध्यम से सेल सतहों को देते हैं। इसके विपरीत, जेल के गठन mucins कई वॉन Willebrand कारक (vWF) की तरह और सिस्टीन अमीर डोमेन है कि गतिशील बहुलक नेटवर्क के गठन के लिए आवश्यक हैं के पास है। बड़े ग्लाइकान सेरीन और threonine अवशेषों apomucin भर में वितरित से जुड़े होते हैं। ये घने हे लिंक्ड oligosaccharides आणविक वजन 4 से 80% करने के लिए योगदान कर सकते हैं। अंतर और अंतर-आणविक डाइसल्फ़ाइड mucin monomers को जोड़ने बांड mucin जेल networ की अखंडता को सुनिश्चितकश्मीर। भारी ग्लाइकोसिलेशन और multimerization का एक परिणाम के रूप में, mucins जानवरों की दुनिया में सबसे बड़ा अणुओं के बीच में हैं और पारंपरिक एसडीएस पृष्ठ polyacrylamide जेल और मानक प्रोटीन सीढ़ी का उपयोग कर मानक जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। इन विधियों 250 केडीए की तुलना में कम आणविक वजन के साथ / अलग प्रोटीन को हल करते हुए mucin monomers MUC16 के मामले में 2 एमडीए तक पहुंच सकता है। हालांकि, उच्च आणविक वजन प्रोटीन सीढ़ी छोटे mucin monomers अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी।, MUC1)।
तकनीक की एक किस्म mucin आकार, रचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। परंपरागत रूप से, mucins के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन, denaturing बफर में isopycnic घनत्व-ढाल centrifugation के माध्यम से अलगाव mucin द्वारा पूरा किया है आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी और immunodetection के द्वारा पीछा (जैसे।, स्लॉट सोख्ता) 5। गतिशील और / या बहु कोण प्रकाश बिखरने mucin युक्त नमूनों की oligomeric राज्य के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं <sup> 1। इसके अलावा, दर-जोनल centrifugation immunodetection और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर सामान्यतः mucins 6 की macromolecular रचना निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री भी mucins यों प्रोटिओलिटिक दरार का पता लगाने और oligosaccharide रचना 1,7,8 का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तरह की तकनीक महंगी हैं, समय लेने वाली और अक्सर बड़ी मात्रा में और / या नमूना के उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। कार्यप्रणाली, यहाँ बताया अर्थात्।, वैद्युतकणसंचलन द्वारा जुदाई mucin, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, कम लागत और उच्च throughput अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता रिश्तेदार mucin quantitation प्रदान करते हैं और बहुलक विधानसभा की खोजबीन की। हालांकि, इस परख उच्च आत्मीयता, उच्च विशिष्टता mucin एंटीबॉडी कि दुर्लभ mucins के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए।, MUC19) या कुछ प्रजातियों (जैसे।, सुअर, भाल)।
Agarose पश्चिमी सोख्ता concentra साथ mucin युक्त नमूनों की एक विस्तृत विविधता को हल करने के लिए उपयुक्त है50 माइक्रोग्राम / (जैसे।, बलगम) 5 मिलीग्राम / एमएल (जैसे।, सेल washes) मिलीलीटर से लेकर माहौल। इस परख 1990 के दशक में शुरू किया गया था और केवल कुछ विशेष प्रयोगशालाओं 9,10 में प्रदर्शन किया गया था। प्रारंभ में, इस तकनीक मानव श्वसन स्राव 11,12 में mucin monomers के उप-जनसंख्या की पहचान में मदद की और जाम कोशिकाओं में oligomerization प्रक्रिया, Golgi उपकरण 13 में डिमर multimerization द्वारा पीछा किया जालिका में डिमर गठन के होते हैं जो की पुष्टि की। हाल ही में, murine mucins के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी के छोटे पशु मॉडल पर अध्ययन (जैसे।, कमी, βENaC, ओवीए चुनौती दी माउस मॉडल mucin) की और से बलगम को दूर करने के उद्देश्य से परीक्षण औषधीय यौगिकों preclinical अध्ययन के लिए अनुसंधान के एक नए क्षेत्र में खोला फेफड़ों 14-17। जीव विज्ञान और उपन्यास की पीढ़ी mucin में एक बढ़ती रुचि का एक परिणाम के रूप में, और अधिक विशिष्ट mucin एंटीबॉडी, हम herei का वर्णनn कार्यप्रणाली agarose जेल वैद्युतकणसंचलन, nitrocellulose और दो रंग अवरक्त फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए वैक्यूम हस्तांतरण द्वारा mucins अलग करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
पश्चिमी सोख्ता इस वीडियो में वर्णित mucin के प्रोटोकॉल आणविक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है और अलग तरह के डीएनए के रूप में बड़े अणुओं, हस्तांतरण करने के लिए, प्रोटीन का पता लगाने के लिए नियमित रूप से त?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Referências
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from ‘normal’ human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
