Mucina Agarosio elettroforesi su gel: Western Blotting per glicoproteine ad alto peso molecolare
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Mucine, le proteine pesantemente glicosilata che rivestono le superfici mucose, si sono evoluti come componente chiave di difesa innata proteggendo l'epitelio contro gli agenti patogeni invasori. Il ruolo principale di queste macromolecole è di facilitare la cattura delle particelle e la clearance favorendo la lubrificazione della mucosa. Durante la sintesi proteica, mucine subiscono intensa O-glicosilazione e multimerizzazione, che aumentano notevolmente la massa e le dimensioni di queste molecole. Queste modificazioni post-traduzionali sono critici per le proprietà viscoelastiche del muco. Come risultato della complessa natura biochimica e biofisica di queste molecole, lavorando con mucine fornisce molte sfide che non possono essere superati mediante metodi di analisi proteica convenzionali. Per esempio, il loro alto peso molecolare impedisce migrazione elettroforetica mediante gel di poliacrilammide regolari e la loro natura appiccicosa provoca l'adesione al tubo sperimentale. Tuttavia, indagando il ruolo di mucine nella salute(Ad es., Mantenendo l'integrità della mucosa) e malattia (ad es., Iperconcentrazione, mucostasis, cancro) ha recentemente guadagnato interesse e mucine sono oggetto di indagine come un obiettivo terapeutico. Una migliore comprensione della produzione e della funzione di macromolecole mucina può portare ad approcci farmaceutici innovativi, ad esempio, inibitori di mucina esocitosi di granuli e / o agenti mucolitici. Pertanto, i protocolli coerenti e affidabili per indagare la biologia mucina sono fondamentali per il progresso scientifico. Qui, descriviamo i metodi convenzionali per separare mucina macromolecole mediante elettroforesi utilizzando un gel, il trasferimento della proteina in membrana di nitrocellulosa, e rilevare il segnale con anticorpi specifici mucina così come lettore di gel a fluorescenza a raggi infrarossi. Queste tecniche sono ampiamente applicabile per determinare mucina quantificazione, multimerizzazione e per testare gli effetti dei composti farmacologici su mucine.
Introduction
Mucine sono normalmente prodotti da superfici mucose che rivestono le cavità esposti all'ambiente esterno (ad es., Respiratorio, digestivo, tratto riproduttivo, superficie oculare), così come gli organi interni (ad esempio, pancreas, della cistifellea, ghiandole mammarie). La presenza di queste glicoproteine mantiene l'idratazione superficiale e forma una barriera fisica contro i patogeni. Anche se la produzione di mucina è essenziale per la salute della mucosa, mucina iperconcentrazione e / o muco aberranti può portare a ostruzione del dotto, la colonizzazione batterica e infiammazione cronica, che può causare danni ai tessuti irreversibili. Un simile cascata di eventi sono stati osservati in diverse malattie, per esempio., La fibrosi cistica 1, otite media cronica 2 e l'infezione cervicovaginale 3. Pertanto, è importante comprendere il ruolo di mucine di salute e di malattia e di stabilire protocolli di routine per l'identificazione di proteine.
Ad oggi, 19 mucine geni sono stati identificati e codificano per grandi catene polipeptidiche che vanno da 1.200 (ad es., MUC1) a 22.000 (per esempio, MUC16) aminoacidi. La famiglia genica mucina può essere divisa in due sottotipi: le mucine associate alla membrana, coinvolte nella segnalazione cellulare e la superficie schermante e le mucine gelificanti, responsabile delle proprietà viscoelastiche del gel muco. mucine associata alla membrana sono per lo più monomerica e allegare alla superficie delle cellule tramite un dominio di membrana-spanning idrofoba. Al contrario, mucine gelificanti possiedono diversi -come e ricche di cisteina domini fattore di von Willebrand (vWF) che sono essenziali per la formazione di reti polimeriche dinamiche. Grandi glicani sono attaccati alla serina e treonina distribuiti in tutto il apomucin. Questi oligosaccaridi densi O-linked possono contribuire fino al 80% del peso molecolare 4. Intra e inter-molecolari legami disolfuro che collegano monomeri mucina garantire l'integrità del networ gel di mucinaK. Come risultato di glicosilazione pesante e multimerizzazione, mucine sono tra le più grandi molecole nel mondo animale e non possono essere analizzati mediante elettroforesi su gel standard utilizzando convenzionale gel SDS-PAGE poliacrilammide e scale proteine standard. Questi metodi risolvono / proteine separate con pesi molecolari inferiori a 250 kDa mentre monomeri mucina possono raggiungere fino a 2 MDa nel caso di MUC16. Tuttavia, scale di proteine ad alto peso molecolare possono essere utilizzati per studiare piccoli monomeri mucina (es., MUC1).
Una varietà di tecniche può essere applicata per studiare dimensioni mucina, conformazione e interazione. Tradizionalmente, caratterizzazione biochimica di mucine si ottiene mucina isolamento tramite isopycnic centrifugazione in gradiente di densità in buffer di denaturazione, seguita da cromatografia dimensione esclusione e immunorilevazione (ad es., Di slot blotting) 5. e / o diffusione della luce multi-angolo dinamico fornire informazioni sullo stato oligomerico di campioni ricchi di mucina <sup> 1. Inoltre, centrifugazione rate-zonale accoppiato con immunolocalizzazione e microscopia elettronica a trasmissione sono comunemente utilizzati per determinare la conformazione macromolecolare di mucine 6. La spettrometria di massa è anche usato per quantificare mucine, rilevare taglio proteolitico e analizzare la composizione oligosaccaride 1,7,8. Tali tecniche sono costose, richiede tempo e spesso richiedono grandi volumi e / o alte concentrazioni di campione. La metodologia descritta, ad esempio., Mucina separazione mediante elettroforesi, è riproducibile, a basso costo e può essere usato in studi di alta throughput per fornire relativa mucina quantificazione e indagare assemblaggio polimero. Tuttavia, questo test richiede ad alta affinità, ad alta specificità anticorpi mucina che potrebbero non essere disponibili per rari mucine (ad es., MUC19) o alcune specie (ad es., Maiale, Ferret).
Agarose Western blotting è adatto per risolvere una varietà di campioni ricchi di mucina con concentrazionezioni che vanno da 50 mg / ml (ad es., lavaggi cellulari) a 5 mg / ml (ad es., espettorato). Questo test è stato introdotto nel 1990 ed è stata eseguita solo in pochi laboratori specializzati 9,10. Inizialmente, questa tecnica ha contribuito ad individuare sottopopolazioni di monomeri mucina nelle secrezioni respiratorie dell'uomo 11,12 e confermato il processo di oligomerizzazione in cellule caliciformi, che consiste di formazione dimero nel reticolo endoplasmatico seguita da dimero multimerizzazione nel Golgi 13. Più di recente, la generazione di anticorpi policlonali contro mucine murini facilitato studi su modelli animali di piccole dimensioni (ad es., Mucina deficienti, modelli murini βENaC, OVA-sfidati) e ha aperto un nuovo campo di ricerca per gli studi preclinici composti test farmacologici che mirano a rimuovere il muco dal i polmoni 14-17. Come risultato di un crescente interesse mucina biologia e la generazione di nuovi e più specifici anticorpi mucina, descriviamo herein metodologia per separare mucine mediante elettroforesi su gel di agarosio, trasferimento vuoto nitrocellulosa e rilevazione fluorescente infrarosso bicolore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di mucina Western blotting descritto in questo video combina tecniche convenzionali utilizzate in biologia molecolare per separare e trasferire grandi macromolecole, come il DNA, con tecniche regolari per il rilevamento di proteine, cioè., Immunoblotting. La stessa tecnica può essere applicata per studiare la biologia di glicosaminoglicani complessi, quali la ripartizione di alta peso molecolare dell'acido ialuronico 18. Sebbene questa tecnica potrebbe essere utilizzata in un'…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Referências
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