ムチンアガロースゲル電気泳動：高分子量の糖タンパク質のためのウェスタンブロッティング
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
ムチン、粘膜表面を裏打ち重くグリコシル化タンパク質は、侵入する病原体に対する上皮を保護することにより先天的防御の重要なコンポーネントとして発展してきました。これらの高分子の主な役割は、粘膜の潤滑を促進しながら粒子捕獲およびクリアランスを容易にすることです。タンパク質合成の間に、ムチンは劇的にこれらの分子の質量と大きさを増加させる強烈なO-グリコシル化および多量体を受けます。これらの翻訳後修飾は、粘液の粘弾性特性のために重要です。これらの分子の複雑な生化学的および生物物理学的性質の結果として、ムチンでの作業は従来のタンパク質分析方法によって克服することができない多くの課題を提供します。例えば、それらの高分子量は、通常のポリアクリルアミドゲルを介して電気泳動を防止し、その粘着性の性質は、実験チューブへの接着を引き起こします。しかし、健康でムチンの役割を調査（ 例えば 、粘膜の整合性を維持する）および疾患（ 例えば 、hyperconcentration、mucostasis、癌）は、最近関心を集めているし、ムチンは、治療標的として研究されています。高分子をムチンの産生および機能のより良い理解は、ムチン顆粒エキソサイトーシスの新規な医薬の手法、 例えば 、阻害剤および/ または粘液溶解薬につながる可能性があります。したがって、一貫性と信頼性の高いプロトコルは、ムチン生物学は科学の進歩のために重要で調査しました。ここでは、アガロースゲルを用いた電気泳動によってムチン高分子を分離し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、ムチン特異的抗体を用いた信号ならびに赤外蛍光ゲルリーダーを検出するための従来の方法を説明します。これらの技術はムチン定量、多量体化を決定し、ムチンの薬理学的化合物の効果を試験するために広く適用されています。
Introduction
ムチンは、通常、外部環境にさらされた空洞を裏打ちする粘膜表面によって製造されている（ 例えば 、呼吸器、消化器、生殖器、眼表面）だけでなく、内臓（ 例えば 、膵臓、胆嚢、乳腺）。これらの糖タンパク質の存在は、表面水和を維持し、病原体に対する物理的障壁を形成します。ムチン生産は不可逆的な組織損傷を引き起こす可能性管閉塞、細菌定着および慢性炎症につながることができ、ムチンhyperconcentrationおよび/または異常な粘液の特性を健康粘膜することが不可欠ですが。イベントの同様のカスケードは、 例えば 、いくつかの疾患で観察される。、嚢胞性線維症1、慢性中耳炎2と頸膣感染3。従って、健康および疾患におけるムチンの役割を理解し、タンパク質同定のためのルーチンのプロトコルを確立することが重要です。
現在まで、19ムチン遺伝子が同定され、1200至るまで大きなポリペプチド鎖のためにエンコードされている（ 例えば 、MUC1）22,000（ 例えば 、MUC16）アミノ酸に。細胞シグナル伝達及び表面遮蔽に関与する膜関連ムチン、およびゲル形成ムチン、粘液ゲルの粘弾性特性を担う：ムチン遺伝子ファミリーは、2つのサブタイプに分類することができます。膜結合型ムチンは主に単量体であり、疎水性の膜貫通ドメインを介して細胞表面に付着します。対照的に、ゲル形成ムチンダイナミックポリマーネットワークの形成に必須であるいくつかのフォンビルブラント因子（vWF）様システインリッチドメインを有します。大グリカンはアポムチン全体に分散セリンおよびトレオニン残基に結合しています。これらの高密度のO結合型オリゴ糖は、分子量4の80％にまで寄与し得ます。ムチンモノマーを接続する分子内および分子間ジスルフィド結合は、ムチンゲルnetworの完全性を確保しますK。重いグリコシル化および多量体の結果として、ムチンは、動物の世界でも最大規模の分子の間であり、従来のSDS-PAGEポリアクリルアミドゲルと標準タンパク質ラダーを使用して、標準的なゲル電気泳動により分析することができません。ムチンモノマーはMUC16の場合は2 MDAに達することができますが、これらの方法は、250キロダルトンより低い分子量を有する/別々のタンパク質を解決します。しかしながら、高分子量のタンパク質ラダーは、小さなムチン単量体を研究するために使用することができる（ すなわち 、MUC1）。
種々の技術は、ムチンのサイズ、コンホメーションと相互作用を研究するために適用することができます。伝統的に、ムチンの生化学的特徴は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび免疫検出に続いて、変性バッファに等密度密度勾配遠心分離を介して分離ムチンによって達成される（ 例えば 、スロットブロット法）5。動的および/または多角度光散乱は、ムチンが豊富なサンプルのオリゴマー状態に関する情報を提供します<SUP> 1。加えて、免疫および透過型電子顕微鏡を用いて結合されたレートゾーン遠心分離は、一般的にムチン6の巨大分子のコンホメーションを決定するために使用されます。質量分析はまた、ムチンを定量化するタンパク質分解的切断を検出し、オリゴ糖組成物1,7,8を分析するために使用されます。このような技術は、時間がかかり、多くの場合は、大容量および/または試料の高濃度を必要とする、高価です。本明細書に記載された方法、 すなわち 、電気泳動による分離ムチン、再現可能な、低コストであり、相対的なムチンの定量化を提供し、ポリマーのアセンブリを調査するためにハイスループット試験に使用することができます。しかし、このアッセイは、（ 例えば 、ブタ、フェレット）希少ムチン（ 例えば 、MUC19）、または特定の種のために利用できない場合があり、高親和性、高特異性ムチン抗体を必要とします。
アガロースウェスタンブロッティングはconcentraとムチン豊富なサンプルの多種多様を解決するのに適しています50μg/ mlの（ 例えば 、細胞洗浄液）から5ミリグラム/ mlの範囲ン（ 例えば 、痰）。このアッセイは、1990年代に導入され、わずか数の専門研究室9,10で行いました。最初は、この技術は、ヒトの気道分泌物11,12にムチン単量体の亜集団を識別助け、ゴルジ装置13における二量体の多量に続いて小胞体内の二量体の形成で構成杯細胞におけるオリゴマー化プロセスを、確認しました。さらに最近では、マウスムチンに対するポリクローナル抗体の生成から粘液を除去することを目的とした試験薬理学的化合物を小動物モデルの研究（ 例えば 、欠損、βENaC、OVAチャレンジマウスモデルをムチン）を促進し、前臨床試験のための研究の新たな分野を開きました肺14-17。生物学や小説、より具体的なムチン抗体の生成をムチン関心の高まりの結果として、我々はhereiを記述しますアガロースゲル電気泳動、ニトロセルロースに真空移送及び二色赤外蛍光検出によりムチンを分離するn個の方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
このビデオで説明したウェスタンブロッティングをムチンのプロトコルは、タンパク質検出のための定期的な技術、 すなわち 、免疫ブロット法で、分離し、DNAなどの巨大分子を、転送するために分子生物学で使用される従来の技術を兼ね備えています。同技術は、高分子量ヒアルロン酸18の破壊のような複雑なグリコサミノグリカンの生物学を研究するために適用することが?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Referências
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