Mucin agarosegel-elektroforese: Western blotting for høy molekylvekt glykoproteiner

Summary

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Abstract

Slimstoffer, tungt-glykosylert proteiner fôr slimhinneoverflater, har utviklet seg som en viktig del av medfødt forsvar ved å beskytte epitelet mot invaderende patogener. Den viktigste rollen til disse makromolekyler er å legge til rette partikkel fangst og rydding mens fremme smøring av slimhinnen. Under proteinsyntese, slimstoffer gjennomgå intens O-glykosylering og multimerization, noe som dramatisk øke massen og størrelsen av disse molekylene. Disse posttranslasjonelle modifikasjoner er kritisk for de viskoelastiske egenskapene til mucus. Som et resultat av den komplekse biokjemiske og biofysiske egenskapene til disse molekylene, som arbeider med slimstoffer gir mange utfordringer som ikke kan overvinnes ved konvensjonelle protein analysemetoder. For eksempel, forhindrer deres høye molekylvekt elektroforetisk migrering via vanlige polyakrylamidgeler og deres klebrige natur bevirker adhesjon til forsøksrøret. Men undersøker rollen til slimstoffer i helse(F.eks., Opprettholde mucosal integritet) og sykdom (f.eks., Hyperconcentration, mucostasis, kreft) har nylig fått interesse og slimstoffer blir etterforsket som et terapeutisk mål. En bedre forståelse av produksjon og funksjon av slimstoffmakromolekyler kan føre til nye farmasøytiske metoder, for eksempel, inhibitorer av mucin granule exocytose og / eller mukolytiske midler. Derfor konsekvente og pålitelige protokoller for å undersøke mucin biologi er avgjørende for vitenskapelige framgang. Her beskriver vi konvensjonelle metoder for å separere slimstoffmakromolekyler ved hjelp av elektroforese ved bruk av en agarosegel, overføres protein til nitrocellulosemembran, og påvisningssignal med mucin-spesifikke antistoffer, så vel som fluorescerende gel-leser. Disse teknikkene er allment gjeldende å bestemme mucin kvantifisering, multimerization og for å teste effekten av farmakologiske forbindelser på slimstoffer.

Introduction

Slimstoffer er vanligvis produsert av slimhinneoverflater som linje hulrom utsatt for ytre miljø (f.eks., Luftveier, fordøyelses, reproduktive traktater, okulær overflate) samt indre organer (f.eks, bukspyttkjertel, galleblæren, brystkjertlene). Tilstedeværelsen av disse glykoproteiner opprettholder overflaten fuktighet og danner en fysisk barriere mot patogener. Selv om mucin produksjon er viktig for slimhinne helse, mucin hyperconcentration og / eller avvikende slim egenskaper kan føre til duct obstruksjon, bakteriell kolonisering og kronisk betennelse, noe som kan føre til uopprettelig skade på vev. En lignende kaskade av hendelser er observert i flere sykdommer, f.eks., Cystisk fibrose ^1, kronisk mellomørebetennelse ² og cervicovaginal infeksjon ^3. Derfor er det viktig å forstå rollen til slimstoffer i helse og sykdom, og for å etablere rutineprotokoller for protein identifikasjon.

til dags dato, 19 slimstoffer gener er identifisert og kode for store polypeptidkjeder som strekker seg fra 1200 (f.eks., MUC1) til 22.000 (f.eks MUC16) aminosyrer. Den slimstoff genfamilien kan deles inn i to undergrupper: membranassosierte slimstoffer, som er involvert i cellesignalisering og overflate skjerming, og de gel-dannende slimstoffer, er ansvarlig for de viskoelastiske egenskaper av slim geler. Membran-forbundet slimstoffer er stort sett monomere og feste til celleoverflaten via en hydrofob membran-omspennende domenet. I motsetning til dette, gel-dannende slimstoffer har flere von Willebrand-faktor (vWF) -lignende og cysteinrike domener som er viktig for dannelsen av dynamiske polymere nettverk. Store glykaner er festet til serin- og treoninresiduer fordelt over hele apomucin. Disse tette O-bundne oligosakkarider kan bidra med opp til 80% av molekylvekten ^4. Intra- og inter-molekylære disulfidbindinger som forbinder mucin monomerer sikre integriteten av mucin gelen network. Som et resultat av tung glykosylering og multimerization, slimstoffer er blant de største molekylene i dyreverdenen og kan ikke bli analysert ved standard gel-elektroforese ved bruk av konvensjonelle SDS-PAGE polyakrylamid gel og standard protein stiger. Disse metoder løser / separate proteiner med molekylvekter lavere enn 250 kDa, mens mucin monomerer kan nå opp til 2 MDA i tilfelle av MUC16. Imidlertid kan høy molekylvekt protein stiger brukes til å studere små mucin-monomerer (f.eks., MUC1).

En rekke forskjellige teknikker kan anvendes for å studere mucin størrelse, konformasjon og interaksjon. Tradisjonelt er biokjemisk karakterisering av muciner oppnådd ved mucin isolering via isopyknisk densitet-gradient-sentrifugering i denaturerende buffer, etterfulgt av størrelse-eksklusjonskromatografi og immundeteksjon (f.eks., Spalte blotting) ^5. Dynamisk og / eller multi-vinkel lysspredning gi informasjon om oligomere staten mucin rike eksempler <sup> 1. I tillegg er hastighets zonal sentrifugering kombinert med immundeteksjon og transmisjonselektronmikroskopi som vanligvis brukes for å bestemme den makromolekylære konformasjon av slimstoffer ^6. Massespektrometri blir også brukt til å kvantifisere slimstoffer, detektere proteolytisk spaltning og analysere oligosakkarider sammensetning ^1,7,8. Slike teknikker er kostbare, tidkrevende og krever ofte store volumer og / eller høye konsentrasjoner av prøven. Metodikken er beskrevet her, det vil si., Mucin separering ved elektroforese, er reproduserbar, lav pris og kan brukes i high-throughput studier for å tilveiebringe relativ mucin kvantifisering og undersøke polymer sammenstillingen. Dette krever imidlertid analysen høy affinitet, høy spesifisitet slimstoff antistoffer som ikke er tilgjengelige for sjeldne slimstoffer (f.eks., MUC19) eller enkelte arter (f.eks., Gris, ilder).

Agarose Western blotting er egnet til å løse en lang rekke av slimstoffrike prøver med konsensjoner som strekker seg fra 50 ug / ml (f.eks., celle vasker) til 5 mg / ml (f.eks., sputum). Denne analysen ble innført på 1990-tallet og ble bare utført i noen få spesialiserte laboratorier ^9,10. Til å begynne med denne teknikken bidro til å identifisere subpopulasjoner av mucin monomerer i humane luftveissekreter ^11,12 og bekreftet oligomerisering prosessen i slimceller, som består av dimerdannelse i det endoplasmatiske retikulum, etterfulgt av dimer multimerization i Golgi-apparatet ^13. Flere nylig, generering av polyklonale antistoffer mot museslimstoffer tilrettelagt studier på små dyremodeller (f.eks., Slimstoffmangelfulle, βENaC, OVA-utfordret musemodeller) og åpnet et nytt forskningsfelt for prekliniske studier testing farmakologiske forbindelser som tar sikte på å fjerne slim fra lungene ^14-17. Som et resultat av en økende interesse i mucin biologi og genereringen av nye, mer spesifikke antistoffer mucin, beskriver vi herein metode for å separere slimstoffer ved agarosegel-elektroforese, vakuum overføring til nitrocellulose og to-fargers infrarøde fluorescerende påvisning.

Protocol

1. Forbered Buffere for mucin Gel Western blotting Forbered en liter av 50x TAE (Tris-acetat-EDTA) buffer. I 700 ml destillert vann (dH 2 O) tilsett 242 g Tris-base (0,4 M), 57,1 g iseddik (veie væske) (0,2 M) og 14,61 g etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (50 mM). Juster pH til 8,0 og gjøre volumet opp til 1 liter med dH 2 O. Forbered 10 ml 10x lasting buffer. Forbered 5 ml 1x TAE buffer. For å gjøre dette, legg til 5 ml glyserol (50%), …

Representative Results

Vi viser representative resultater fra slimstoffekspresjon etter agarosegel-elektroforese i Balf fra lungene til mus (figur 1). I dette eksempel brukte vi agarosegel for å vise oppregulering av slimstoffproduksjonen som følge av IL-13 behandlingen av Tg-MUC5AC-mus-modellen. Western blot viser en visuell representasjon av slimstoffekspresjon, som kan brukes for en kvantitativ analyse av multimeren eller monomer båndsignal intensitet (figur 2). Denne me…

Discussion

Protokollen av mucin Western blotting som er beskrevet i denne video kombinerer konvensjonelle teknikker som brukes i molekylær biologi for å separere og overføre store makromolekyler, slik som DNA, med regelmessige teknikker for proteindeteksjon, f.eks., Immunoblotting. Den samme teknikken kan brukes til å studere biologi av komplekse glykosaminoglykaner, slik som nedbrytning av høy molekylvekt hyaluronsyre ^18. Selv om denne teknikken kan brukes i et bredt spekter av analyser, avhenger vellykke…

Materials

Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50g
20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1L
NaCl	Fisher	S271-1	1kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500mL
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200ug
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100ug
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences