Муцин Электрофорез в агарозном геле: Вестерн блот для высокой молекулярной массой гликопротеинов
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Муцины, что сильно гликозилированные белки, выстилающих поверхности слизистой оболочки, эволюционировали в качестве ключевого компонента врожденной защиты, защищая эпителий от вторжения патогенов. Основная роль этих макромолекул, чтобы облегчить улавливание частиц и зазор, продвигая смазывание слизистой оболочки. В процессе синтеза белков, муцинов претерпевают интенсивную О-гликозилирование и мультимеризацию, что значительно увеличивают массу и размер этих молекул. Эти посттрансляционные модификации являются критически важными для вязкоупругих свойств слизи. В результате сложного биохимического и биофизической природы этих молекул, работая с муцин обеспечивает множество проблем, которые не могут быть преодолены с помощью традиционных методов анализа белков. Например, их высокой молекулярной массы предотвращает электрофоретической миграции через регулярные полиакриламидном геле и их липкая природа вызывает адгезию к экспериментальному НКТ. Однако, исследуя роль муцинах в области здравоохранения(Например., Поддержание целостности слизистых оболочек) и болезни (например., Hyperconcentration, mucostasis, рак) в последнее время приобрел интерес и муцинов исследуются в качестве терапевтической мишени. Лучшее понимание производства и функции макромолекул муцин может привести к новым фармацевтическим подходам, например, ингибиторы муцина экзоцитоза гранул и / или муколитических агентов. Таким образом, последовательные и надежные протоколы для исследования муцин биологии имеют решающее значение для научного прогресса. Здесь мы описываем обычные методы для разделения муцин макромолекул электрофореза в агарозном геле, белка-переносчика в нитроцеллюлозную мембрану, и детектировать сигнал с муцин-специфических антител, а также инфракрасный считыватель флуоресцентный гель. Эти методы широко применяются для определения муцина, мультимеризацию количественный и испытать влияние фармакологических соединений на муцин.
Introduction
Муцины обычно получают поверхности слизистых оболочек, выстилающих полости подвергаются воздействию внешней среды (например., Органов дыхания, пищеварения, репродуктивная, поверхности глазного яблока), а также внутренних органов (например, поджелудочной железы, желчного пузыря, молочных желез). Присутствие этих гликопротеинов поддерживает гидратации поверхности и образует физический барьер против патогенов. Несмотря на то, муцин производства имеет важное значение для здоровья слизистых оболочек, муцина hyperconcentration и / или отклоняющиеся свойства слизи может привести к непроходимости протоков, бактериальной колонизации и хроническое воспаление, которое может привести к повреждению тканей необратимым. Подобный каскад событий , наблюдаются при некоторых заболеваниях, например., Муковисцидоз 1, хронический средний отит 2 и цервиковагинальными инфекции 3. Поэтому важно понять роль муцинах в отношении здоровья и болезни и установить обычные протоколы для идентификации белков.
Встретиться, 19 генов муцины были идентифицированы и кодируют для крупных полипептидных цепей в диапазоне от 1200 (например., MUC1) до 22000 (например, MUC16) аминокислоты. Муцина семейство генов можно разделить на два подтипа: мембрана-ассоциированной муцинов, участвующих в клеточной сигнализации и защиты поверхности, а также гелеобразующих муцинов, отвечает за вязкоупругих свойств слизи гелей. Ассоциированных с мембранами муцинов в основном мономерный и прикрепляются к поверхности клеток посредством гидрофобного трансмембранный домен. В противоположность этому, гелеобразующих муцинов обладают несколькими фактора фон Виллебранда (ФВ) -как и богатых цистеином домены, которые имеют важное значение для формирования динамических полимерных сетей. Большие гликаны прикреплены к серина и треонина, распределенных по всему apomucin. Эти плотные О-связанных олигосахаридов , может достигать до 80% от молекулярной массы 4. Внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи, соединяющие муцин мономеры обеспечивают целостность муцин геля Networк. В результате тяжелой гликозилирования и мультимеризацию, муцинов являются одними из крупнейших молекул в животном мире и не могут быть проанализированы с помощью стандартного гель-электрофореза с использованием обычного геля ДСН-ПААГ-электрофорез в полиакриламидном и стандартные белковые лестницы. Эти методы решения / отдельные белки с молекулярными массами ниже 250 кДа, в то время как муцин мономеры могут доходить до 2 МДА в случае MUC16. Тем не менее, с высокой молекулярной массе белка лестницы могут быть использованы для изучения малых мономеров муцина (т.е.., MUC1).
Различные методы могут быть применены для изучения муцин размер, конформации и взаимодействия. Традиционно, получение биохимических характеристик муцинов осуществляется путем муцина развязки через изопикнического градиенте плотности центрифугирования в денатурирующем буфере, а затем гель- фильтрационной хроматографии и эксклюзионной иммунологического (например., Слот – блоттинга) 5. Динамические и / или рассеяния света многоугольных предоставляют информацию о олигомерного состояния муцина богатых образцов <SUP> 1. Кроме того, скорость-зональному центрифугированию в сочетании с иммунологического и просвечивающей электронной микроскопии, как правило , используются для определения макромолекулярную конформацию муцинами 6. Масс – спектрометрия также используется для количественного определения муцины, обнаружения протеолитического расщепления и анализа олигосахаридов состава 1,7,8. Такие методы требуют больших затрат, отнимает много времени и часто требуют больших объемов и / или высокие концентрации образца. Методика описана в данном документе, то есть., Муцин разделение с помощью электрофореза, воспроизводима, низкая стоимость и может быть использовано в исследованиях с высокой пропускной способностью, чтобы обеспечить относительную муцина и количественного изучения полимера в сборе. Тем не менее, этот анализ требует высокого сродства, высокой специфичности муцина антитела , которые не могут быть доступны для редких муцинах (например., MUC19) или некоторые виды (например., Свинья, хорек).
Агарозном вестерн-блоттинга подходит для решения широкого спектра муцин богатых образцов с Concentraции в диапазоне от 50 мкг / мл (например., Cell оврагам) до 5 мг / мл (например., мокрота). Этот анализ был введен в 1990 – е годы и была проведена лишь в нескольких специализированных лабораториях 9,10. Изначально этот метод позволил выявить субпопуляции мономеров муцина в дыхательных путей человека 11,12 и подтвердили процесса олигомеризации в бокаловидных клеток, которая состоит из димеров в эндоплазматической сети с последующим димера мультимеризацию в аппарате 13 Гольджи. Совсем недавно, поколение поликлональных антител против мышиных муцинах способствовали исследования на небольших животных моделях (например., Муцин несовершенные, βENaC, OVA-оспариваемые модели мыши) и открыли новую область исследований для проведения доклинических исследований тестирования фармакологических препаратов , направленных на удаление слизи из легкие 14-17 лет. В результате растущего интереса к биологии муцина и поколение романа, более специфические антитела муцин, мы опишем hereiп методология для разделения муцины с помощью электрофореза в агарозном геле, передачи вакуума к нитроцеллюлозы и двухцветной обнаружения инфракрасного флуоресцентного.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол муцина Вестерн – блоттинга , описанного в этом видео сочетает в себе традиционные методы , используемые в молекулярной биологии для разделения и передачи больших макромолекулы, такие как ДНК, с регулярными методами для обнаружения белка, то есть., Иммуноблоттинга. Тот же м?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Referências
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from ‘normal’ human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
