Mucin agarosgelelektrofores: Western blotting för hög molekylvikt Glykoproteiner
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Muciner, de tungt glykosylerade proteiner foder slemhinneytor, har utvecklats som en nyckelkomponent i medfödda försvar genom att skydda epitel mot invaderande patogener. Huvuduppgiften för dessa makromolekyler är att underlätta partikel fångst och avslut samtidigt främja smörjning av slemhinnan. Under proteinsyntesen, muciner genomgår intensiv O-glykosylering och multimerise, vilket dramatiskt öka massan och storleken av dessa molekyler. Dessa posttranslationella modifieringar är kritiska för de viskoelastiska egenskaperna hos slem. Som en följd av den komplexa biokemiska och biofysiska naturen hos dessa molekyler, som arbetar med muciner ger många utmaningar som inte kan övervinnas med hjälp av konventionella proteinanalysmetoder. Till exempel hindrar deras höga molekylvikt elektro migration genom regelbundna polyakrylamidgeler och deras klibbiga natur orsakar vidhäftning till experimentell slang. Men undersöker rollen av muciner i hälsa(Eg., Upprätthålla mucosal integritet) och sjukdom (eg., Hyperconcentration, mucostasis, cancer) har nyligen vunnit intresse och muciner utreds som ett terapeutiskt mål. En bättre förståelse för produktion och funktion av mucin makromolekyler kan leda till nya farmaceutiska metoder, till exempel, hämmare av mucin granulat exocytos och / eller slemlösande medel. Därför konsekventa och pålitliga protokoll undersöka mucin biologi är avgörande för vetenskapliga framsteg. Här beskriver vi konventionella metoder för att separera mucin makromolekyler genom elektrofores med användning av en agarosgel, överför protein in nitrocellulosamembran, och detekteringssignal med mucin-specifika antikroppar samt infraröda fluorescerande gel läsare. Dessa tekniker är allmänt tillämpas för att bestämma mucin kvantifiering, multimerise och för att testa effekterna av farmakologiska föreningar på muciner.
Introduction
Muciner normalt produceras av slemhinneytor som kantar hålrum exponeras för den yttre miljön (eg., Respiratoriskt, matsmältnings, reproduktiva skrifter, okulär yta) samt inre organ (t.ex. pankreas, gallblåsa, mjölkkörtlar). Närvaron av dessa glykoproteiner bibehåller ytan hydratisering och bildar en fysisk barriär mot patogener. Även mucin produktion är viktigt att mukosala hälsa, mucin hyperconcentration och / eller avvikande slem egenskaper kan leda till kanal obstruktion, bakteriell kolonisering och kronisk inflammation, vilket kan orsaka irreversibel vävnadsskada. En liknande kaskad av händelser observeras i flera sjukdomar, t ex., Cystisk fibros 1, kronisk otitis media 2 och cervicovaginal infektion 3. Därför är det viktigt att förstå vilken roll muciner i hälsa och sjukdom och att upprätta rutin protokoll för proteinidentifiering.
Hittills, 19 muciner gener har identifierats och kodar för stora polypeptidkedjor som sträcker sig från 1200 (eg., MUC1) till 22.000 (t.ex. MUC16) aminosyror. Mucin genfamiljen kan delas in i två undertyper: membranassocierade muciner, som är involverade i cellsignalering och yta avskärmning, och gelbildande muciner, som ansvarar för de viskoelastiska egenskaperna hos slem geler. Membran-associerade muciner är mestadels monomera och fäst till cellytorna via en hydrofob membranöverspännande domänen. I kontrast, gelbildande muciner har flera von Willebrand-faktor (vWF) -liknande och cysteinrika domäner som är väsentliga för bildningen av dynamiska polymera nätverk. Stora glykaner är knutna till serin och treonin-rester fördelade i apomucin. Dessa täta O-bundna oligosackarider kan bidra med upp till 80% av molekylvikten 4. Intra- och intermolekylära disulfidbindningar som förbinder mucin monomerer säkerställa integriteten hos mucin gel nätverk. Som ett resultat av tunga glykosylering och multimerise, muciner är bland de största molekylerna i djurvärlden och kan inte analyseras med standard gelelektrofores med användning av konventionell SDS-PAGE polyakrylamidgel och standardiserade protein stegar. Dessa metoder löser / separera proteiner med molekylvikter lägre än 250 kDa medan mucin monomerer kan nå upp till 2 MDa i fallet med MUC16. Emellertid kan med hög molekylvikt protein stegar användas för att studera små mucin-monomerer (dvs.., MUC1).
En mängd olika tekniker kan användas för att studera mucin storlek, konformation och interaktion. Traditionellt är biokemisk karakterisering av muciner åstadkommas genom mucin isolering via isopyknisk densitetscentrifugering i denaturering buffert, följt av storleks kromatografi och immunodetection (eg., Slot blotting) 5. Dynamisk och / eller flera vinklar ljusspridning ger information om oligomera tillstånd av mucin-rika prover <sup> 1. Dessutom är hastighets zonal centrifugering i kombination med immunodetektion och transmissionselektronmikroskopi som vanligen används för att bestämma den makromolekylära konformationen av muciner 6. Masspektrometri används också för att kvantifiera muciner, upptäcka proteolytisk klyvning och analysera oligosackarid sammansättning 1,7,8. Sådana tekniker är kostsamma, tidskrävande och kräver ofta stora volymer och / eller höga koncentrationer av provet. Den metod som beskrivs häri, dvs., Mucin separation genom elektrofores, är reproducerbar, låg kostnad och kan användas i hög genomströmning studier för att ge relativ mucin kvantifiering och undersöka polymerenhet. Emellertid kräver denna analys med hög affinitet, hög specificitet mucin antikroppar som inte finns för sällsynta muciner (eg., MUC19) eller vissa arter (t.ex.., Gris, iller).
Agaros Western blotting är lämplig för att lösa en mängd olika mucin-rika prover med koncentioner som sträcker sig från 50 | ig / ml (t ex., cell tvättar) och 5 mg / ml (t ex., sputum). Denna analys infördes på 1990-talet och endast utförs i ett fåtal specialiserade laboratorier 9,10. Initialt, hjälpte denna teknik identifiera subpopulationer av mucin-monomerer i humana luftvägssekretioner 11,12 och bekräftade oligomerisering processen i bägarceller, som består av dimerbildning i det endoplasmatiska retiklet följt av dimer multimerise i Golgi-apparaten 13. På senare tid, generering av polyklonala antikroppar mot murina muciner underlättas studier på små djurmodeller (t ex., Mucin bristfälliga, βENaC, OVA-utmanade musmodeller) och öppnade ett nytt fält av forskning för prekliniska studier testa farmakologiska substanser avsedda att avlägsna slem från lungorna 14-17. Som ett resultat av ett ökat intresse för mucin biologi och generering av nya, mer specifika mucin antikroppar, beskriver vi herein den metod för att separera muciner med agarosgelelektrofores, vakuumöverföring till nitrocellulosa och två-färg infraröda fluorescerande detektering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet av mucin Western blotting beskrivs i denna video kombinerar konventionella tekniker som används inom molekylärbiologi för att separera och överföra stora makromolekyler, såsom DNA, med regelbundna tekniker för proteindetektion, det vill säga., Immunoblotting. Samma teknik kan tillämpas för att studera biologi komplexa glykosaminoglykaner, såsom nedbrytningen av hög molekylvikt hyaluronsyra 18. Även om denna teknik skulle kunna användas i ett brett område av analyser förlit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Referências
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from ‘normal’ human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
