Musin Agaroz jel elektroforezi: Yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için Western Blot
Summary
Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.
Abstract
Mukinler, mukoza yüzeyleri astar ağır glikozile proteinler, işgalci patojenlere karşı epitel koruyarak doğal savunma önemli bir bileşeni olarak gelişmiştir. Bu makromoleküllerin ana rolü mukozasının yağlama teşvik ederken parçacık yakalama ve temizliğini kolaylaştıracak etmektir. Protein sentezi sırasında, müsinler dramatik bu moleküllerin kütle ve boyutunu artırmak yoğun O-glikosilasyon ve multimerizasyonunu, tabi. Bu post-translasyonel modifikasyonlar, mukus viskoelastik özellikleri için çok önemlidir. Bu moleküllerin karmaşık biyokimyasal ve biyofiziksel doğasının bir sonucu olarak, Müsinlerin ile çalışan geleneksel protein analiz yöntemleri ile üstesinden gelinemez birçok zorluklarla sağlar. Örneğin, yüksek molekül ağırlıklı düzenli poliakrilamid jeller vasıtasıyla elektroforetik göç engeller ve bunların yapışkan doğa deneysel boru yapışmayı neden olur. Ancak, sağlıkta Müsinlerin rolünü araştıran(Örn., Mukozal bütünlüğünü korumak) ve hastalık (örn., Hyperconcentration, mucostasis, kanser) son zamanlarda kazanmıştır faiz ve müsinler terapötik hedef olarak araştırılmaktadır. Üretim ve müsin makro moleküllerin işlevi daha iyi anlaşılması, yeni farmasötik yaklaşımlar, örneğin, musin granül Ekzositoz ve / veya mukolitik ajanlar önleyicileri neden olabilir. Bu nedenle, tutarlı ve güvenilir protokoller müsin biyoloji bilimsel ilerleme için kritik öneme sahiptir araştırmak. Burada, bir agaroz jelde elektroforez ile müsin makromolekülleri ayrı nitroselüloz zar içine protein transferi ve müsin özgü antikorlarla sinyali hem de kızıl ötesi floresan jeli okuyucu tespit etmek için bilinen yöntemler açıklanmaktadır. Bu teknikler müsin kantitatif, multimerizasyonunu belirlemek ve Müsinlerin farmakolojik bileşiklerin etkilerini test etmek yaygın uygulanabilir.
Introduction
Mukinlerin normalde dış ortama maruz kalan boşlukları hat mukoza yüzeyleri tarafından üretilen (örn., Solunum, sindirim, üreme yolları, oküler yüzey) yanı sıra iç organları (örneğin, pankreas, safra kesesi, meme bezleri). Bu glikoproteinlerin varlığı yüzey hidrasyon korur ve patojenlere karşı fiziksel bir bariyer oluşturur. musin üretimi geri dönüşümsüz doku hasarına neden olabilir kanal tıkanıklığının, bakteri kolonizasyonu ve kronik inflamasyon, yol açabilir, müsin hyperconcentration ve / veya anormal mukus özelliklerini sağlık mukozal için gerekli olmasına rağmen. Olayların benzer bir çağlayan, çeşitli hastalıklarda gözlenir örneğin., Kistik fibroz 1, kronik otitis media 2 ve servikovaginal enfeksiyon 3. Nedenle, sağlıkta ve hastalıkta Müsinlerin rolünü anlamak için ve protein belirlenmesi için rutin protokoller oluşturulması önemlidir.
Bugüne kadar19 müsinler genler tespit ve 1.200 arasında değişen geniş polipeptit zincirleri için kodlamak edilmiştir (örn., MUC1) 22000 (örneğin, MUC16) amino asitler için. musin gen ailesi, iki alt tipe ayrılabilir: mukus jellerin viskoelastik özellikleri için hücre sinyal ve yüzey koruyucu yer membrana bağlı müsinler, ve jel oluşturucu müsinler sorumludur. Zara bağlı müsinler çok monomer ve bir hidrofobik membran kapsayan alan aracılığıyla, hücre yüzeylerine ekleyin. Bunun tersine, jel-oluşturucu müsinler, dinamik polimerik ağların oluşumu için gerekli olan bir kaç von Willebrand faktörü (vWF) -benzeri ve sistein bakımından zengin alanlanna sahiptir. Geniş glikanları serin ve apomucin boyunca dağılmış treonin kalıntılarına eklenir. Bu yoğun O-bağlı oligosakaritler molekül ağırlığı 4% 80 kadar katkıda bulunabilir. müsin monomerleri bağlayan intra ve inter-moleküler disülfid bağları müsin jel networ bütünlüğünü sağlamakk. Ağır glikosilasyon ve multimerizasyon bir sonucu olarak, mukinler, hayvan dünyanın en büyük moleküller arasında ve geleneksel SDS-PAGE poliakrilamid jel ve standart protein merdiven kullanılarak standart jel elektroforezi ile analiz edilemez. müsin monomerler MUC16 durumunda 2 MDA kadar ulaşabilir ise bu yöntemler, 250 kDa daha düşük moleküler ağırlıkları / ayrı proteinler çözmek. Bununla birlikte, yüksek moleküler ağırlıklı bir protein merdivenleri küçük müsin monomerlerin incelemek için kullanılabilir (örneğin,., MUC1).
çeşitli teknikler müsin boyut, konformasyon ve etkileşimi incelemek için uygulanabilir. Geleneksel olarak, müsinlerin biyokimyasal karakterizasyonu boyut dışlama kromatografi ve İmmuno, ardından denatüre edici tampon maddesi içinde izopiknik yoğunluk gradyanlı santrifüj yoluyla izole musin ile gerçekleştirilir (örn.,, Yuva blot) 5. Dinamik ve / veya çok açılı bir ışık saçılım müsin zengin örneklerin oligomerik durumu ile ilgili bilgiler sağlayabilir <sup> 1. Buna ek olarak, immün ve transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte kuru bölgeli santrifüj yaygın müsinlerin 6 makromoleküler yapısını belirlemek için kullanılır. Kütle spektrometrisi, aynı zamanda, müsinleri ölçmek proteolitik bölünme algılamak ve oligosakarit bileşimin 1,7,8 analiz etmek için kullanılır. Bu teknikler zaman alıcıdır ve çoğu zaman büyük miktarlarda ve / veya örneğin, yüksek konsantrasyonlara ihtiyaç maliyetlidir. Yöntem, burada tarif edilen, yani., Elektroforez ile ayrılması, musin, yeniden üretilebilir ve düşük maliyetli olan ve göreli müsin kantitatif sağlar ve polimer grubunu araştırmak için yüksek verimli çalışmalarında kullanılabilir. Ancak, bu deney nadir Müsinlerin için mevcut olmayabilir yüksek afiniteli, yüksek özgüllük müsin antikorlar gerektirir (örn., MUC19) ya da bazı türlerin (örn., Domuz, gelincik).
Agaroz Western lekeleme konsantrasyonları ile müsin zengin örneklerin ve çeşitli çözmek için uygundur50 ug / ml (örn., hücre yıkama), 5 mg / ml (örneğin., balgam) arasında değişen leri. Bu tahlil 1990'larda tanıtıldı ve sadece birkaç özel laboratuvarlarda 9,10 gerçekleştirildi. Başlangıçta, bu teknik, insan solunum salgıları 11,12 müsin monomerlerin subpopülasyonunun belirlemek yardımcı oldu ve Golgi aygıtında 13 dimer multimerizasyon ardından endoplazmik retikulum dimer oluşumu oluşur goblet hücrelerinde oligomerizasyon işlemini doğruladı. Daha yakın zamanlarda, fare Müsinlerin karşı poliklonal antikorların üretimi mukus ortadan kaldırmayı hedefleyen test farmakolojik ajanlar küçük hayvan modellerinde çalışmalar (örn., Eksik, βENaC, OVA-meydan fare modelleri müsin) kolaylaştırdı ve preklinik çalışmalar için yeni bir araştırma alanı açtı akciğerler 14-17. biyoloji ve roman nesil müsin giderek artan ilgi sonucunda, daha spesifik müsin antikorlar, biz herei tarifN yöntemi, agaroz jel elektroforezi, nitroselüloz ve iki renkli kızıl ötesi floresan saptama vakum transferi ile müsinleri ayırmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu video açıklanan Batı blotting müsin protokol protein tespiti için düzenli teknikleri, yani., Immunoblotting ile, ayrı ve DNA gibi büyük makromoleküllerin, transfer moleküler biyolojide kullanılan geleneksel teknikler birleştirir. Aynı teknik, yüksek moleküler ağırlıklı hyalüronik aside 18 bozulması gibi karmaşık glikozaminoglikanlar biyolojisi çalışma uygulanabilir. Bu teknik deneylerin geniş bir aralıkta kullanılabileceğini, ancak başarılı bir agaroz Western leke…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.
Materials
| Tris Base | Sigma | T6060-1kg | 1kg |
| Glacial Acetic Acid | Sigma | ARK2183-1L | 1L |
| EDTA | Sigma | EDS-100g | 100g |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | 1L |
| Bromophenol Blue | Sigma | 114391-5g | 5g |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Sigma | L6026-50g | 50g |
| 20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer | Promega | V4261 | 1L |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1kg |
| Trisodium Citrate (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1kg | 1kg |
| 10 mM DTT (dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 25g |
| Milk Powder | Saco | Instant non-fat dry milk | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500mL |
| Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples) | Rockland antibodies and assays | 600-101-215 | 1 mg |
| UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples) | UNC | ||
| H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples) | Santa Cruz | sc-20119 | 200ug |
| 45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples) | Abcam | ab3649 | 100ug |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0.5mg |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0.5mg |
| Electrophoresis Gel Box and Casting Tray | Owl Seperation Systems | ||
| Power Supply Box | Biorad | Model 200/20 | |
| Membrane Blotting Paper | Amersham | 10600016 | |
| Whatman Paper and Nitrocellulose membrane | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v | Expotech USA | 230600-2 | |
| Odyssey Infrared Fluorescence System | LI-COR Biosciences |
Referências
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid. Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).
- Wang, Y. Y., et al. IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).
- Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. Mucins in the mucosal barrier to infection. Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).
- Thornton, D. J., et al. Mucus glycoproteins from ‘normal’ human tracheobronchial secretion. Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).
- Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).
- Kesimer, M., Sheehan, J. K. Mass spectrometric analysis of mucin core proteins. Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).
- van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin. J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).
- Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).
- Sheehan, J. K., et al. Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions. Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).
- Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule. J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).
- Sheehan, J. K., et al. Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin. J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).
- Ehre, C., et al. Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).
- Livraghi, A., et al. Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment. J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).
- Martino, M. B., et al. The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production. Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).
- Nguyen, L. P., et al. Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).
- Papakonstantinou, E., et al. COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid. Chest. , (2015).
- Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures. Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).
