Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi
Summary
A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.
Abstract
Die Studie von polymikrobiellen Interaktionen über die taxonomische Königreiche, die Pilze, Bakterien und Viren sind nicht zuvor in Bezug auf, wie virale Mitglieder des microbiome beeinflussen nachfolgende Mikroben-Interaktionen mit diesen Virus infizierten Wirtszellen untersucht worden. Das Zusammenleben von Virus mit Bakterien und Pilzen besteht hauptsächlich darin, die auf den Schleimhäuten der Mundhöhle und des Genitaltrakts. Mucosal Zellen, insbesondere solche mit persistenten chronischen oder persistenten latenten Virusinfektionen, könnte einen erheblichen Einfluss auf die Mitglieder des microbiome durch Virus Veränderung in der Anzahl und Art der Rezeptoren zum Ausdruck gebracht haben. Änderung in Wirtszellmembran Architektur in veränderter Fähigkeit der nachfolgenden Mitglieder der normalen Flora und opportunistischen Erregern würde den ersten Schritt in die Biofilmbildung, das heißt, die Einhaltung zu initiieren. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung und visuelle Untersuchung des HSV Wirkung auf die Einleitung BIOFILm – Bildung (Adhärenz) von S. aureus und C. albicans.
Introduction
Der menschliche microbiome umfasst unterschiedliche Organismen aus verschiedenen taxonomischen Königreiche, die im Körper geografischen Regionen teilen. Die Einhaltung der Zelloberflächen ist ein wichtiger erster Schritt in die Biofilmbildung, die Teil des microbiome Kolonisierung ist. Eingeschlossen in die microbiome können Viren sein, die chronische und persistente Infektionen verursachen. Die chronische Zellinfektion durch diese Viren kann eine Veränderung in mutmaßlichen Rezeptor Verfügbarkeit führen. 1,2 Zusätzlich Zelleintritt durch intrazelluläre Erreger auch Wirts Membranfluidität / Hydrophobizität, die wiederum verändern können Anbringung weiterer microbiome Mitglieder, einschließlich Bakterien und Pilzen beeinflussen könnten . Um die Wechselwirkungen zu verstehen, die zwischen diesen mehrere Krankheitserreger, die Co-Lokalisierung in den gleichen Regionen des menschlichen Wirts auftreten können, müssen wir die Wechselwirkung von Krankheitserregern zu studieren können, die das Spektrum von taxonomischen Königreiche, die an der Schleimhautoberfläche darstellen.
t "> Die Herpesviridae sind eine Familie von Mikroben in 100% der Menschen als ständige Mitglieder des microbiome 3,4. Darüber hinaus können sie auch beide beharrlich vergossen werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Symptomen. Insbesondere Herpes – simplex – Virus-1 und Herpes-simplex-Virus-2 (HSV-1 und HSV-2, jeweils) sind permanent Mitglieder der microbiome im oronasopharynx und Genitaltrakt. in immunkompetenten Individuen sowohl HSV-1 und HSV-2 verursachen Gingivostomatitis, sowie Genital – Herpes 5-8. an diesen Stellen verursacht HSV eine latente durch chronische persistente asymptomatischen Virus gekennzeichnet Infektion zu vergießen 9. Eintritt von HSV in Zellen führt zu Veränderungen in der Oberflächenexpression von nectins, Heparansulfat, Lipid Rafts und Herpes – Virus Eintrag Mediator / Tumor – Nekrose Faktor – Rezeptor (HVEM / TNFr) 25.10. Diese potenziell gemeinsamen Rezeptoren für einige Bakterien und Pilze darstellen, zB S. aureus und C. albicans, die während opportunistische Erreger,können auch als Mitglieder der Schleimhaut microbiome des oronasopharynx 26,27 befinden. Innerhalb des oronasopharynx S. aureus und C. albicans belegen zwei verschiedene Stellen der Besiedlung. In Hosts mit natürlichen Zähnen wird die Mundschleimhaut durch HSV-1 geteilt und C. albicans, während die vorderen Nasen nares werden von S. besetzt aureus 28. Doch trotz de – vitro – Ergebnisse , dass S. aureus hält sich an den Mund Epithelzellen, 29,30 S. aureus ist selten von oralen Proben isoliert , wenn die normale Gewebe vorhanden 29,30 ist. Es ist wenig bekannt , Genitaltrakt über Co-Kolonisation Nischen jenseits der klinischen Befunde , dass S. aureus ist mit aerober Vaginitis verbunden sind , gekennzeichnet durch Genital – Entzündung, Entladung und Dyspareunie, während C. albicans erzeugt Schleimhautläsionen ähnlich der in der Mundhöhle beobachtet 31-35. Obwohl also diese Mitglieder der Mund- und Genital microbiome Quer taxonomischen Reiche wenig bekannt ist , ihre Interaktion , wie sie Auswirkungen ihrer Fähigkeit , die Bildung von Biofilmen durch die Einhaltung der Wirtszelloberfläche 5 über einzuleiten. Dieses Protokoll wurde effektiv die funktionellen Folgen der Co-Kolonisation / Infektion zu bestimmen, angewandt.Protocol
1. HSV-Stämme und Handhabung Hinweis: Recombinant kein Ausbreiten HSV-1 (KOS) gL86 und HSV-2 (KOS) 333gJ – mit beta-Galactosidase – Reporteraktivität verwendet wurden von V. Twiari 36,37 zur Verfügung gestellt. Verwenden Sie Virus aus einem Los und bei -80 ° C bei einer 1: 1-Verhältnis von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und Magermilch bis zur Verwendung. Vor viral Menge Lagerung, Viruskonzentration von o – Nitrophenyl-?…
Representative Results
Der Grad der Zuverlässigkeit der Daten , die aus System in diesem Bericht beschrieben wird , in Abbildung 2 af 38 gezeigt. Durch die Verwendung dieses Systems die Modulation von Staphylokokken und Pilz Wechselwirkung mit viral infizierte Zellen und deren Wirkung auf jedes Anhaften des anderen können abgegrenzt werden. Diese Arten von Studien erfordern mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung , wie in den 3 und 4 gezeig…
Discussion
Derzeit liegen keine Informationen über komplexe Wechselwirkungen zwischen permanent zu semi-permanenten Mitglieder des Host microbiome , die mehrere taxonomische Domänen kreuzen, dh prokaryotischen, eukaryotischen und viral. Deshalb entwickelten wir ein neuartiges de System – vitro – Modell Biofilm Einleitung von S. zu studieren aureus und C. albicans auf HSV-1 oder HSV-2 infizierten HeLa 229 (HeLa – Zellen) 38. Die HeLa-Zellen Modellsystem stellt einen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).
Materials
| C.albicans | |||
| BBL Sabouraud Dextrose | BD | 211584 | |
| Fungisel Agar | Dot Scientific | 7205A | |
| S.aureus | |||
| Mannitol Salt Agar | Troy Biologicals | 7143B | |
| Sheep blood agar | Troy Biologicals | 221239 | |
| Hela cells | |||
| 1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CM | |
| Gentamicin 50mg/ml | Sigma | 1397 | 50µg/ml final concentration in the complete DMEM |
| Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% final concentration in the complete DMEM |
| Other medium and reagents | |||
| ONPG | Thermo Scientific | 34055 | |
| Ultra-Pure X gal | Invitrogen | 15520-018 | |
| 1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) | Corning | 20-021-CV | |
| 1XPBS | Dot Scientific | 30042-500 | |
| RIPA Lysis | Life Technologies | 89901 | |
| Staining | |||
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| HSV 1&2, specific for gD | ViroStat | 196 | |
| DAPI | SIGMA | D8417-5MG | |
| Gram Crystal Violet | Troy Biologicals | 212527 | |
| Supplies | |||
| Petri dish 100X15 | Dot Scientific | 229693 | |
| Petri dish 150X15 | Kord Valmark | 2902 | |
| 96-Well plates | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | |
| 24-well plates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Culture tubes 100×13 | Thomas Scientific | 9187L61 | |
| Cover slip circles, 12mm | Deckglaser | CB00120RA1 |
Referências
- Palu, G., et al. Effects of herpes-simplex virus type-1 infection on the plasma-membrane and related functions of HeLa S3 cells. J Gen Virol. 75, 3337-3344 (1994).
- Vitiello, G., et al. Lipid composition modulates the interaction of peptides deriving from herpes simplex virus type I glycoproteins B and H with biomembranes. Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1808, 2517-2526 (2011).
- Bradley, H., Markowitz, L. E., Gibson, T., McQuillan, G. M. Seroprevalence of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2-United States, 1999-2010. J. Infect. Dis. 209, 325-333 (2014).
- Szpara, M. L., et al. Evolution and diversity in Human Herpes Simplex Virus genomes. J Virol. 88, 1209-1227 (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Herpes Simplex Virus Type I infection: overview on relevant clinico-pathological features. J Oral Pathol Med. 37, 107-121 (2008).
- Looker, K. J., Garnett, G. P. A systematic review of the epidemiology and interaction of herpes simplex virus types 1 and 2. Sex. Transm. Infect. 81, 103-107 (2005).
- Taylor, T. J., Brockman, M. A., McNamee, E. E., Knipe, D. M. Herpes simplex virus. Front Biosci. 7, 752-764 (2002).
- Bernstein, D. I., et al. Epidemiology, clinical presentation, and antibody response to primary infection with Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 in young women. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 56, 344-351 (2013).
- Sacks, S. L., et al. HSV shedding. Antiviral Res. 63, 19-26 (2004).
- Brandhorst, T. T., et al. Structure and Function of a Fungal Adhesin that Binds Heparin and Mimics Thrombospondin-1 by Blocking T Cell Activation and Effector Function. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Green, J. V., et al. Heparin-Binding Motifs and Biofilm Formation by Candida albicans. Journal of Infectious Diseases. 208, 1695-1704 (2013).
- Khalil, M. A., Sonbol, F. I. Investigation of biofilm formation on contact eye lenses caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus. Niger. J. Clin. Pract. 17, 776-784 (2014).
- Shanks, R. M. Q., et al. Heparin stimulates Staphylococcus aureus biofilm formation. Infection and Immunity. 73, 4596-4606 (2005).
- Tiwari, V., et al. Role for 3-O-sulfated heparan sulfate as the receptor for herpes simplex virus type 1 entry into primary human corneal fibroblasts. J Virol. 80, 8970-8980 (2006).
- Delboy, M. G., Patterson, J. L., Hollander, A. M., Nicola, A. V. Nectin-2-mediated entry of a syncytial strain of herpes simplex virus via pH-independent fusion with the plasma membrane of Chinese hamster ovary cells. Virol J. 3, (2006).
- Di Giovine, P., et al. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Hauck, C. R. Cell adhesion receptors – signaling capacity and exploitation by bacterial pathogens. Medical Microbiology and Immunology. 191, 55-62 (2002).
- Kramko, N., et al. Early Staphylococcus aureus-induced changes in endothelial barrier function are strain-specific and unrelated to bacterial translocation. Int. J. Med. Microbiol. 303, 635-644 (2013).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Molecular vision. 17, 3166-3174 (2011).
- Sato, R., et al. Impaired cell adhesion, apoptosis, and signaling in WASP gene-disrupted Nalm-6 pre-B cells and recovery of cell adhesion using a transducible form of WASp. Int. J. Hematol. 95, 299-310 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-alpha in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2878-2887 (2009).
- Stump, J. D., Sticht, H. Mutations in herpes simplex virus gD protein affect receptor binding by different molecular mechanisms. J Molecu Model. 20, (2014).
- Zelano, J., Wallquist, W., Hailer, N. P., Cullheim, S. Expression of nectin-1, nectin-3, N-cadherin, and NCAM in spinal motoneurons after sciatic nerve transection. Experimental Neurology. 201, 461-469 (2006).
- Akhtar, J., et al. HVEM and nectin-1 are the major mediators of herpes simplex virus 1 (HSV-1) entry into human conjunctival epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 4026-4035 (2008).
- Heo, S. K., et al. LIGHT enhances the bactericidal activity of human monocytes and neutrophils via HVEM. J. Leukoc. Biol. 79, 330-338 (2006).
- . National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report. Am J Infect Control. 32, 470-485 (2004).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 39, 1093-1093 (2004).
- Colacite, J., et al. Pathogenic potential of Staphylococcus aureus strains isolated from various origins. Ann. Microbiol. 61, 639-647 (2011).
- Colombo, A. V., et al. Quantitative detection of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa in human oral epithelial cells from subjects with periodontitis and periodontal health. J. Med. Microbiol. 62, 1592-1600 (2013).
- Merghni, A., Ben Nejma, M., Hentati, H., Mahjoub, A., Mastouri, M. Adhesive properties and extracellular enzymatic activity of Staphylococcus aureus strains isolated from oral cavity. Microb Pathogen. 73, 7-12 (2014).
- Donders, G. G. G., et al. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Bjog. 109, 34-43 (2002).
- Li, J. R., McCormick, J., Bocking, A., Reid, G. Importance of vaginal microbes in reproductive health. Repro Sci. 19, 235-242 (2012).
- Jarvis, W. R. The epidemiology of colonization. Infect Cont Hosp Epidemiol. 17, 47-52 (1996).
- Okonofua, F. E., Akonai, K. A., Dighitoghi, M. D. Lower genital-tract infections in infertile nigerian women compared with controls. Genitourin Med. 71, 163-168 (1995).
- Nenoff, P., et al. Mycology – an update Part 2: Dermatomycoses: Clinical picture and diagnostics. J Der Deutschen Dermatol Gesellschaft. 12, 749-779 (2014).
- Hubbard, S., et al. Contortrostatin, a homodimeric disintegrin isolated from snake venom inhibits herpes simplex virus entry and cell fusion. Antivir. Ther. 17, 1319-1326 (2012).
- Shukla, S. Y., Singh, Y. K., Shukla, D. Role of Nectin-1, HVEM, and PILR-α in HSV-2 entry into human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50, 2878-2887 (2009).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Herpes simplex virus (HSV) modulation of Staphylococcus aureus. and Candida albicans.initiation of HeLa 299 cell-associated biofilm. Curr Microbiol. , (2016).
- Alva-Murillo, N., Lopez-Meza, J. E., Ochoa-Zarzosa, A. Nonprofessional phagocytic cell receptors involved in Staphylococcus aureus internalization. Biomed Res Internat. , (2014).
- Calderone, R. A., Scheld, W. M. Role of fibronectin in the pathogenesis of candidal infections. Reviews of infectious diseases. 9, 400-403 (1987).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European journal of cell biology. 79, 672-679 (2000).
- Mao, L., Franke, J. Symbiosis, dysbiosis, and rebiosis-The value of metaproteomics in human microbiome monitoring. Proteomics. 15, 1142-1151 (2015).
- Christopher, R. A., Kowalczyk, A. P., McKeown-Longo, P. J. Localization of fibronectin matrix assembly sites on fibroblasts and endothelial cells. J Cell Sci. 110, 569-581 (1997).
- Heino, J., Kapyla, J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules. Current Pharm Des. 15, 1309-1317 (2009).
- Hynes, R. O., et al. A large glycoprotein lost from the surfaces of transformed cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 312, 317-342 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology. 24, 389-399 (2005).
- Schwarzbauer, J. E., DeSimone, D. W. Fibronectins, their fibrillogenesis, and in vivo functions. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).
- Abdelmegeed, E., Shaaban, M. I. Cydooxygenase inhibitors reduce biofilm formation and yeast-hypha conversion of fluconazole resistant Candida albicans. J. Microbiol. 51, 598-604 (2013).
- Gow, N. A. Germ tube growth of Candida albicans. Current topics in medical mycology. 8, 43-55 (1997).
- Liu, Y. P., Filler, S. G. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot. Cell. 10, 168-173 (2011).
- Lu, Y., Su, C., Liu, H. Candida albicans hyphal initiation and elongation. Trends Microbiol. 22, 707-714 (2014).
- Kabir, M. A., Hussain, M. A., Ahmad, Z. Candida albicans: A model organism for studying fungal pathogens. ISRN microbiology. 2012, 538694 (2012).
- Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Evaluation of adhesion forces of Staphylococcus aureus along the length of Candida albicans hyphae. BMC Microbiol. 12, (2012).
- Peters, B. M., et al. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology-Sgm. 158, 2975-2986 (2012).
Citar este artigo
Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).