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Imunologia e Infecção

जीवाणु और कवक द्वारा वायरस से संक्रमित कोशिकाओं पर Biofilm दीक्षा का निर्धारण

Published: July 06, 2016
doi:
10.3791/54162
, , ,
1Department of Microbiology and Immunology,Midwestern University

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

वर्गीकरण राज्यों है कि कवक, बैक्टीरिया और वायरस शामिल भर polymicrobial बातचीत का अध्ययन पहले से कैसे Microbiome के वायरल सदस्यों को इन वायरस से संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के साथ बाद में सूक्ष्म जीव संबंधों को प्रभावित करने के लिए सम्मान के साथ जांच नहीं की गई है। बैक्टीरिया और कवक के साथ वायरस के सह बस्ती मुख्यतः मौखिक गुहा और जननांग पथ की श्लैष्मिक सतहों पर मौजूद है। श्लैष्मिक कोशिकाओं, विशेष रूप से लगातार क्रोनिक या लगातार अव्यक्त वायरल संक्रमण के साथ उन लोगों के लिए, एक महत्वपूर्ण संख्या में वायरस परिवर्तन के माध्यम से Microbiome के सदस्यों पर प्रभाव और व्यक्त रिसेप्टर्स के प्रकार हो सकता था। मेजबान कोशिका झिल्ली वास्तुकला में संशोधन biofilm गठन, यानी, पालन करने में पहला कदम आरंभ करने के लिए सामान्य वनस्पति और अवसरवादी रोगजनकों के बाद सदस्यों की बदल क्षमता पर नतीजा होगा। इस अध्ययन बायोफिल की दीक्षा पर quantitation और एचएसवी के प्रभाव के दृश्य परीक्षा के लिए एक विधि का वर्णनएम गठन (पालन) एस के ऑरियस और सी सफेद।

Introduction

मानव शरीर में Microbiome का हिस्सा है कि भौगोलिक क्षेत्रों के कई वर्गीकरण राज्यों से विविध जीवों भी शामिल है। सेल सतहों का पालन biofilm गठन, जो Microbiome उपनिवेशन प्रक्रिया का हिस्सा है में एक आवश्यक पहला कदम है। Microbiome में शामिल वायरस है कि पुरानी और लगातार संक्रमण का कारण हो सकता है। इन वायरस से पुरानी सेल संक्रमण ख्यात रिसेप्टर उपलब्धता में एक परिवर्तन का कारण बन सकता है। 1,2 इसके अलावा, intracellular रोगजनकों द्वारा सेल प्रविष्टि भी मेजबान झिल्ली तरलता / hydrophobicity जो बदले में अन्य Microbiome सदस्यों की कुर्की, बैक्टीरिया और कवक सहित बदल सकता है प्रभावित कर सकता है । आदेश बातचीत है कि इन कई रोगजनकों मानव मेजबान का एक ही भौगोलिक क्षेत्रों में है कि सह स्थानीय बनाना बीच हो सकता है समझने के लिए, हम रोगज़नक़ों कि mucosal सतह पर उपस्थित वर्गीकरण राज्यों के स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करने का बातचीत का अध्ययन करने के लिए सक्षम होना चाहिए।

टी "> Herpesviridae Microbiome के स्थायी सदस्य के रूप में मनुष्य की 100% में मौजूद रोगाणुओं के एक परिवार के हैं 3,4। इसके अलावा वे भी लगातार दोनों की उपस्थिति और लक्षण के अभाव में बहाया जा सकता है। विशेष रूप से, दाद सिंप्लेक्स वायरस -1 और दाद सिंप्लेक्स वायरस -2 (एचएसवी -1 और एचएसवी -2, क्रमशः) oronasopharynx और जननांग पथ में Microbiome के स्थायी सदस्य हैं। प्रतिरक्षा सक्षम व्यक्तियों में, दोनों एचएसवी -1 और एचएसवी -2 कारण gingivostomatitis, साथ ही जननांग दाद 5-8। इन साइटों पर, एचएसवी पुरानी लगातार स्पर्शोन्मुख वायरल nectins, Heparan सल्फेट, लिपिड राफ्ट और herpesvirus प्रवेश मध्यस्थ की सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन में कोशिकाओं परिणामों में बहा 9। एचएसवी की एंट्री / ट्यूमर नेक्रोसिस की विशेषता एक अव्यक्त संक्रमण का कारण बनता है कारक रिसेप्टर (HVEM / TNFR) 10-25। कुछ बैक्टीरिया और कवक, जैसे एस ऑरियस और सी albicans के लिए ये संभावित साझा प्रतिनिधित्व रिसेप्टर्स, जबकि जो अवसरवादी रोगजनकों,यह भी oronasopharynx 26,27 की श्लैष्मिक Microbiome के सदस्यों के रूप में निवास कर सकते हैं। Oronasopharynx एस के भीतर ऑरियस और सी सफेद उपनिवेशवाद की दो अलग-अलग साइटों पर कब्जा। प्राकृतिक दांत के साथ होस्ट में, मौखिक mucosa एचएसवी -1 और सी द्वारा साझा किया जाता है सफेद, पूर्वकाल नाक nares एस के कब्जे में हैं, जबकि ऑरियस 28। हालांकि, के बावजूद इन विट्रो निष्कर्ष है कि एस ऑरियस मुंह उपकला कोशिकाओं का पालन करता है, 29,30 एस ऑरियस बार बार मौखिक नमूनों से अलग है जब सामान्य ऊतक वर्तमान 29,30 है। लिटिल नैदानिक ​​निष्कर्षों से परे है कि जननांग पथ सह-उपनिवेशवाद आलों के विषय में जाना जाता है एस ऑरियस एरोबिक योनिशोथ साथ जुड़ा हुआ है, जननांग सूजन, मुक्ति और dyspareunia के द्वारा होती है, जबकि सी सफेद मौखिक गुहा 31-35 में मनाया समान श्लैष्मिक घावों पैदा करता है। इस प्रकार, हालांकि मौखिक और जननांग microbi के इन सदस्योंome पार वर्गीकरण थोड़ा उनकी बातचीत के विषय में जाना जाता है राज्यों के रूप में यह प्रभावों मेजबान कोशिका की सतह से 5 पालन के माध्यम से biofilm गठन आरंभ करने की क्षमता। इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से सह-उपनिवेशवाद / संक्रमण के कार्यात्मक परिणाम निर्धारित करने के लिए लागू किया गया है।

Protocol

1. एचएसवी खींच और हैंडलिंग नोट: संयोजक गैर-प्रसार के एचएसवी -1 (कोस) gL86 और एचएसवी -2 (कोस) 333gJ – बीटा galactosidase संवाददाता इस्तेमाल किया वी Twiari 36,37 द्वारा प्रदान किया गया गतिविधि के साथ। एक 1 में -80 डिग्री स?…

Representative Results

इस रिपोर्ट में वर्णित प्रणाली से प्राप्य डेटा की मजबूती के स्तर पर चित्रा 2 वायुसेना 38 में दिखाया गया है। इस प्रणाली के उपयोग के माध्यम virally संक्रमित कोशिकाओं और एक दूसरे के पालन प?…

Discussion

वर्तमान में कोई जानकारी होस्ट Microbiome की अर्द्ध स्थायी सदस्यों को बताया कि कई वर्गीकरण डोमेन, यानी, प्रोकार्योटिक यूकेरियोटिक और वायरल पार करने के लिए स्थायी बीच जटिल संबंधों पर उपलब्ध है। इसलिए हम ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml Sigma 1397 50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1XPBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100X15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150X15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100×13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12mm Deckglaser CB00120RA1
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BiofilmViral InfectionOpportunistic PathogensStaphylococcus AureusCandida AlbicansHSVCMVAdenovirusHeLa CellsC. AlbicansGerm TubeYeast FormAdherenceAttachmentMicrobiomeMultiplicity Of InfectionReporter VirusParaformaldehyde GlutaraldehydeDMEMTrypsinHBSSOD 600
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Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).
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