Method Article

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

DOI:

10.3791/54168

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June 11th, 2016

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1Division of Hematology/Oncology, Boston Children’s Hospital, 2Harvard Medical School, 3Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, 4Harvard Stem Cell Institute, 5Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology, 6Howard Hughes Medical Institute, 7Division of Hematologic Malignancies, Dana-Farber Cancer Institute

In This Article

Summary

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Este protocolo fornece instruções passo a passo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabióticos de diferentes origens genéticas. Quando combinado com os recursos de imagem incomparáveis do embrião de peixe-zebra, esse método fornece um meio excepcionalmente poderoso para investigar funções autônomas e não autônomas de células para genes candidatos de interesse.

Abstract

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parabiosis cirúrgica de dois animais de diferentes origens genéticas cria um cenário único para estudar células-intrínseca contra papéis de células-extrínseca para genes candidatos de interesse, comportamentos migratórios de células e sinais de secretada em configurações genéticas distintas. Porque os animais parabiótica compartilhar uma circulação comum, qualquer sangue ou fator transmitidas pelo sangue de um animal serão trocadas com o seu parceiro e vice-versa. Assim, as células e os factores moleculares derivadas de um fundo genético pode ser estudado no contexto de um segundo fundo genético. Parabiose de ratinhos adultos tem sido amplamente utilizado para a pesquisa do envelhecimento, cancro, diabetes, obesidade, e desenvolvimento do cérebro. Mais recentemente, parabiose de embriões de peixe-zebra foi usado para estudar a biologia do desenvolvimento da hematopoiese. Em contraste com os ratinhos, a natureza transparente de embriões de peixe-zebra permite a visualização directa das células no contexto parabiótica, tornando-se um método único e poderoso para a investigação de fmecanismos celulares e moleculares undamental. A utilidade desta técnica, no entanto, é limitado por uma curva de aprendizagem para gerar os embriões de peixe-zebra parabiótica. Este protocolo fornece um método passo-a-passo sobre como cirurgicamente fundir o blástulas de dois embriões de peixe-zebra de diferentes origens genéticas para investigar o papel de genes candidatos de interesse. Além disso, os embriões de peixe-zebra parabiótica são tolerantes ao choque térmico, tornando o controlo temporal da expressão do gene possível. Este método não requer um sofisticado set-up e tem amplas aplicações para estudar a migração de células, especificação de destino, e diferenciação in vivo durante o desenvolvimento embrionário.

Introduction

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Criação de mosaicos genéticos (quimeras) entre o tipo selvagem e animais geneticamente modificados é uma estratégia bem estabelecida e clássica para a investigação de células-intrínseca contra as funções das células-extrínseca de genes candidatos 1-6. Blástula transplante no peixe-zebra tem sido amplamente utilizada para gerar embriões quiméricos para estudos de célula-autonomia 7-9. Dependendo do tecido de interesse, no entanto, pode ser um desafio para segmentar previsivelmente células do doador para o tecido desejado (por exemplo, sangue) 1-3, 7-9. Geneticistas rato há muito utilizados métodos cirúrgicos parabiótica para g....

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Protocol

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Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Hospital Infantil de Boston. Este protocolo é modificado de um método previamente publicado a 15.

1. Preparação de Reagentes (dias ou semanas de antecedência)

  1. Prepare 1,5% pratos revestidos por agarose. Adicionar 1,5 g de agarose a 100 ml de meio de Zebrafish E3 em uma garrafa de Erlenmeyer. Calor, dissolver a agarose, e depois verter em aproximadamente 5 ml de 100 mm de diâmetro x 20 mm de placas de petri profundas.
    Nota: Estes são usados ​​para dechorionation de embriões (Etapa 3.1) e para a cirurgia parabiótica (Passo 3.3). Armazenar....

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Results

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Consistente com os estudos anteriormente publicados 15, parabiótica fusão bem sucedida de embriões de peixe-zebra depende do armazenamento temporário e da orientação dos dois embriões e a concentração de metilcelulose. Com apenas alguns simples, ferramentas de baixo custo, blástulas tetra desenvolvimento cirurgicamente fundidos foram gerados que cresceu em embriões parabiótica com circulação compartilhada. Estas ferramentas incluída uma pipeta Pasteur modificado, uma bomba de .......

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Discussion

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Fusion parabiótica tem sido uma ferramenta poderosa para investigar as funções celulares de genes candidatos em modelos murinos adultos e embriões de galinha 10-14. Mais recentemente, um método de fusão blástula foi descrito para a geração de embriões de peixe-zebra siameses 15. No presente protocolo, tutoriais em vídeo são usados ​​para demonstrar e descrever a metodologia para a criação de embriões de peixe-zebra parabiótica de diferentes origens genéticas para estudar funções temporais, células-.......

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Disclosures

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Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Acknowledgements

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Agradecemos a Julie R. Perlin pelos comentários úteis sobre o manuscrito. D.I.S. é apoiado por doações da Sociedade Americana de Hematologia, da Cooley's Anemia Foundation e do NIH (K01DK085217 e R03DK100672). E.J.H. é membro do Howard Hughes Medical Institute da Helen Hay Whitney Foundation. B.L. é Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. é apoiado por uma bolsa Irvington do Cancer Research Institute e um Young Investigator Prêmio da Conquer Cancer Foundation da ASCO. L.I.Z. é apoiado por doações do NIH (R01CA103846, P01HL032262 e R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute e é investigador do Howard Hughes Medica....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MetilceluloseSigmaM0387
Componentes individuais para E3/HCR:Para 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4
NaCl (cloreto de sódio)Sigma-AldrichS9888
KCl (cloreto de potássio)Sigma-AldrichP9541
CaCl2 (cloreto de cálcio di-hidratado)Sigma-Aldrich223506
MgSO4 (sulfato de Magnessium heptahidratado)Sigma-Aldrich230391
Hepes (1M) solução tampãoThermoFisher15630-080
NomeEmpresa<strong>Catálogo Número
Antibióticos:
Pen/Strepgibco da Life technologies15140-120
Sal de ampicilina sódicaSigma Life ScienceA0166
Sulfato de canamicina de Streptomyces kanamyceticusSigma Life ScienceK1377
Nome CompanyNúmero de catálogo
50 mg/ml Pronase de Streptomyces griseusRoche11459643001
vidro capilar usado para agulhas (Vidro capilar & Filamentos)Sutter InstrumentITEM#: BF 100-50-10
Agulhas de provocação com cabos de madeiraFisher ScientificS07894
Pipetas de vidro PasteurFisherbrand13-678-20A
Bomba de pipeta de 10 ml (verde) (Pipete de bomba de pipeta)Novatech InternationalF37898-0000
Placas de Petri de plástico de 100 mm de diâmetro / 20 mm de profundidade (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, TRANSPARENTE, COM ABERTURAS,
DESIGN PESADO, 15 UNID./SACO)		Greiner Bio-one664102
Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, aniônico, lisina fixávelThermoFisherD-1976
PTU. o estoque de trabalho é de 0,003% (50x é 0,15%). para 500 ml, 0,75 g de N-feniltioureiaSigma-AldrichP7629
Tricaine (pó) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)Western Chemical IncMS 222
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)Invitrogen16520100
(apenas a de ponta larga, eu acho)Fisherbrand137115AM
Placas de 6 poços com fundo de vidro usadas para imagensMatTekP06G1.5-20-F
ponta de carregamento de gel ocidental de plástico fixada na extremidade de uma agulha de dissecação com cabo de madeira (pontas GELoader)Eppendorf22351656
lamínulas de cobertura de vidro, lâminas e graxa a vácuo se estiver montando para um microscópio vertical:
Graxa de vácuo ( Dow Corning® graxa de silicone de alto vácuo
incolor, peso 5,3 oz (tubo) )		Dow CorningZ273554
lamínulasde cobertura de vidroCiências da Vida Corning2960-244
Pipeta de transferência de plástico

References

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  1. Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  2. Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).

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