الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
في الثقافة المختبر من خلايا الإنسان الأولية الظهارية الشعب الهوائية (HBE) باستخدام الظروف واجهة الهواء السائل يوفر نموذجا مفيدا لدراسة عمليات تمايز الخلايا الهوائية وظيفة. في السنوات القليلة الماضية، واستخدام ناقلات lentiviral للتسليم التحوير أصبح ممارسة شائعة. في حين أن هناك تقارير تنبيغ الهوائية الخلايا الظهارية متباينة تماما مع بعض lentiviruses كتبته الزائفة غير بفيروس نقص المناعة البشرية، وكفاءة تنبيغ الشاملة هي عادة ما تكون أقل من 15٪. بروتوكول المقدمة هنا يوفر طريقة موثوقة وفعالة لإنتاج lentiviruses وتنبيغ الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان الأساسية. استخدام الخلايا الظهارية القصبية غير متمايزة، تنبيغ في وسائل الإعلام نمو الظهارية الشعب الهوائية، في حين أن نعلق الخلايا، مع تعدد العوامل إصابة 4 يوفر الكفاءات قريبة من 100٪. يصف هذا البروتوكول، خطوة بخطوة، وإعداد وتركيز ناقلات lentiviral ارتفاع عيار والعشرينعملية تنبيغ ه. ويناقش التجارب هي التي تحدد شروط الثقافة الأمثل لتحقيق transductions ذات كفاءة عالية للخلايا الظهارية القصبية الإنسان الأساسية.
Introduction
وقد وفرت تطوير، lentiviruses pseudotyped-تكرار معيب (LV) الباحثين وسيلة آمنة وفعالة لتوصيل الجينات المحورة في المختبر 1. بسبب التعبير على المدى الطويل، يمكن لهذه LV أيضا أن تستخدم لإيصال العوامل العلاجية في الجسم الحي 2،3. إنتاج LV يتطلب شارك في ترنسفكأيشن الكلى الجنينية البشرية (كلوة) خلايا مع العديد من البلازميدات: ناقل نقل، هفوة التعبئة والتغليف / بول، مراجعة التعبئة والتغليف، ومغلف حويصلي فيروس التهاب الفم بروتين سكري (VSV-G) البلازميدات. تعتبر أنظمة التعبئة والتغليف الجيل الثالث أكثر أمانا من أنظمة الجيل الثاني ليتم ترميز الجينات تزيد السرعة على البلازميد التعبئة والتغليف منفصلة، مما يقلل من إمكانية إعادة التركيب لإنتاج تكرار الفيروسة البطيئة المختصة. على الرغم من أن أنظمة التعبئة والتغليف الجيل الثاني المحصول الكلي خمس وحدات التنبيغ أعلى أضعاف، وانقسام الجينوم الفيروسي الأصلي لخلقانخفض نظام الجيل الثالث على مستوى تنبيغ فقط الحد الأدنى 3،4.
بينما خطوط الخلايا يمكن transduced أكثر سهولة وكفاءة، تحولت الباحثين تركيزها على الخلايا الأولية، لأن هذه هي أكثر تمثيلا في الجسم الحي الأنسجة 5،6. ومع ذلك، الخلايا الأولية مستعصية على تنبيغ. في حين تم الإبلاغ عن تنبيغ الخلايا الظهارية مجرى الهواء متباينة تماما، لم تتجاوز الكفاءة العامة 15٪ 7.
وصفت هنا هو عبارة عن بروتوكول يتيح إنتاج لفس ارتفاع عيار. ويرد نهج خطوة بخطوة لتحقيق ما يقرب من 100٪ كفاءة ترنسدوكأيشن إلى خلايا HBE الأولية. وبشكل أكثر تحديدا، يصف بروتوكول الظروف المثلى ثقافة دور أساسي للنجاح 3. لفترة وجيزة، و transfected الخلايا 293T كلوة باستخدام lentiviral pCDH ناقلات التعبير مع EF-1 المروج القيادة التعبير عن تعزيز الفلورية الخضراء بروتين (EGFP) أو mCherry، وهو بروتين أحمر فلوري، ونظام التعبئة والتغليف من الجيل الثالث. يتم جمع لفس صدر في وسائل الإعلام 24-72 ساعة في وقت لاحق. تتركز جزيئات الفيروس مع البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، وهي طريقة مريحة وسهلة للتركيز الفيروسي، قبل تقدير عيار استخدام عدة انزيم مرتبط P24 مستضد المناعي فحص (ELISA). وفي وقت لاحق، وtransduced خلايا HBE الأولية غير متمايزة في وسائل الاعلام انتشار (القصبي متوسط النمو الظهاري أو BEGM) 8، في حين يعلق (بعد أن trypsinized)، في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) عامل 4، مضيفا بروميد hexadimethrine واحتضان لمدة 16 ساعة ( بين عشية وضحاها). ثم يسمح للخلايا للتمييز. منذ يتم التعبير عن التحوير الفيروسي على المدى الطويل (باستخدام المروج المناسب، انظر المناقشة)، وسيتم الحفاظ التعبير في جميع أنحاء التمايز في ظهارة الهوائية كاذبة أو يمكن أن يتسبب (باستخدام المروج محرض) بعد التمايز.
<p clالحمار = "jove_content"> هذا البروتوكول هو من اهتمام واسع للباحثين الذين يرغبون في استخدام خلايا HBE الأولية بدلا من خطوط الخلايا، ويمكن أن تكون قابلة للتكيف مع غيرها من الصعب تنبيغ أنواع الخلايا.Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المذكورة هنا يؤكد ما يقرب من 100٪ من الكفاءة تنبيغ. ومع ذلك، هناك خطوات خلال العملية التي تعتبر مهمة لتحقيق هذا الهدف. على سبيل المثال، أثناء عملية ترنسفكأيشن، وجود رواسب في مزيج التنبيغ (قطرة) أو في طبق اليوم بعد تنبيغ (أرقام 1B ود) وكلاهما ذا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الوكالة الحياة التحالف الجهاز الانتعاش من جامعة ميامي لتوفير الرئتين. كما نشكر الدكتورة ليزا Künzi لإعداد الحمض النووي المستخدمة في التجارب هو مبين في الشكل 2B و 3-D، الدكتور بن Gerovac وليزا نوفاك لفيروس mCherry المستخدمة في التجارب في الأرقام 3A إلى C. كما نشكر غابرييل Gaidosh من مرفق التصوير، قسم طب العيون في جامعة ميامي.
وقد رعت هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، ومؤسسة التليف الكيسي ومضيفات معهد البحوث الطبية الدكتور ماتياس Salathe.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
Referências
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors–design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
