Optimal Lentivirus Production et culture cellulaire Conditions nécessaires pour réussir Cellules transduction humains primaires épithéliales bronchiques
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
La culture in vitro de cellules humaines primaires épithéliales bronchiques (HBE) en utilisant des conditions d'interface air-liquide fournit un modèle utile pour étudier les processus de différenciation et de la fonction des cellules des voies respiratoires. Au cours des dernières années, l'utilisation de vecteurs lentiviraux pour la livraison de transgène est devenu pratique courante. Bien qu'il existe des rapports de transduction des cellules épithéliales des voies aériennes complètement différenciées avec certains lentivirus pseudo-typés non-VIH, l'efficacité globale de transduction est habituellement inférieure à 15%. Le protocole présenté ici fournit un procédé fiable et efficace pour produire des lentivirus et pour transduire des cellules épithéliales bronchiques humaines primaires. En utilisant des cellules epitheliales bronchiques non différenciées, une transduction dans un milieu de croissance épithéliale bronchique, tandis que les cellules se fixent, avec une multiplicité d'infection par le facteur de 4 fournit des rendements proches de 100%. Ce protocole décrit, étape par étape, la préparation et la concentration de titre élevé vecteurs lentiviraux et eprocessus de transduction de e. Il examine les expériences qui ont déterminé les conditions de culture optimales pour atteindre transductions très efficace de cellules épithéliales bronchiques humaines primaires.
Introduction
Le développement de la réplication défectueuse, lentivirus pseudotypés (LV) a fourni aux chercheurs une méthode sûre et efficace pour délivrer des transgènes in vitro 1. En raison de leur expression à long terme, celles – ci LV pourrait également être utilisé pour la délivrance d'agents thérapeutiques in vivo 2,3. La production de LV nécessite co-transfection de rein embryonnaire humain (HEK) cellules avec plusieurs plasmides: vecteur de transfert, emballage gag / pol, emballage rev et enveloppe vésiculaire glycoprotéine du virus de la stomatite (VSV-G) plasmides. Les systèmes d'emballage de troisième génération sont considérés comme plus sûrs que les systèmes de seconde génération , car le gène rev est codé sur un plasmide séparé emballage, réduisant ainsi la possibilité d' une recombinaison pour produire un lentivirus compétent pour la replication. Bien que les systèmes d'emballage de deuxième génération donnent cinq unités de pliage totales plus élevées de transduction, la scission du génome viral d'origine pour créerle système de troisième génération a diminué le niveau de transduction que très peu 3,4.
Bien que les lignées de cellules peuvent être transduites plus facilement et efficacement, les chercheurs ont déplacé leur attention vers les cellules primaires, car ceux – ci sont plus représentatifs de tissus in vivo 5,6. Cependant, les cellules primaires sont réfractaires à la transduction. Alors que la transduction des cellules de l' épithélium des voies respiratoires totalement différenciées ont été rapportés, le rendement global ne dépasse pas 15% 7.
Décrite ici est un protocole qui permet la production de LVs à titre élevé. Une approche étape par étape est décrite pour atteindre près de 100% d'efficacité de transduction dans les cellules HBE primaires. Plus précisément, le protocole décrit les conditions optimales de culture instrumentales pour réussir 3. En bref, les cellules HEK 293T sont transfectées en utilisant le lentiviral pCDH vecteur d'expression avec l'EF-1 promoteur dirigeant l'expression d'une meilleure fluorescente verteprotéine (EGFP) ou mCherry, une protéine fluorescente rouge, et un système d'emballage de troisième génération. LVs libérés dans les médias sont collectés 24-72 heures plus tard. Les particules virales sont concentrées avec du polyéthylène glycol (PEG), un procédé commode et rapide de la concentration virale, avant l'estimation du titre en utilisant un dosage par immunosorbant antigène p24 lié à une enzyme (ELISA) trousse. Par la suite, les cellules HBE primaires non différenciées sont transduits dans un milieu de prolifération (milieu de croissance de l' épithélium bronchique ou BEGM) 8, tandis que la fixation (après avoir été trypsinisées), à une multiplicité d'infection (MOI) facteur 4, en ajoutant le bromure d'hexadiméthrine et incubation pendant 16 heures ( pendant la nuit). Les cellules sont ensuite autorisées à se différencier. Étant donné que le transgène viral est exprimé à long terme (au moyen du promoteur approprié, voir la discussion), l'expression sera maintenue tout au long de la différenciation dans un épithélium respiratoire pseudostratifié ou peut être induite (en utilisant un promoteur inductible) après la différenciation.
<p class = "jove_content"> Ce protocole est d'un grand intérêt pour les chercheurs qui veulent utiliser les cellules HBE primaires au lieu de lignées cellulaires, et pourrait être adaptable à d'autres difficiles à transduction types de cellules.Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici assure près de 100% l'efficacité de transduction. Cependant, il y a des étapes au cours du processus qui sont importants pour atteindre cet objectif. Par exemple, pendant le processus de transfection, la présence de précipités dans le mélange de transduction (goutte) ou dans le plat du jour après transduction (figures 1 b et d) sont pertinents pour une bonne transfection. L'absence d'un précipité ou la présence d'agglomérats peut êtr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l'Agence de l'Université de Miami vie Alliance Organ Recovery pour fournir les poumons. Nous remercions également le Dr Lisa Künzi pour la préparation de l'ADN utilisé pour les expériences présentées dans la figure 2B et 3-D, le Dr Ben Gerovac et Lisa Novak pour le virus mCherry utilisé pour les expériences sur les figures 3A à C. Nous remercions également Gabriel Gaidosh de l'installation d'imagerie, Département d'ophtalmologie à l'Université de Miami.
Cette étude a été parrainée par des subventions du NIH, la Fondation de la mucoviscidose et de l'agent de bord Institut de recherche médicale au Dr Matthias Salathé.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
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