Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell'uomo epiteliali bronchiali
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
In coltura in vitro di cellule primarie umane epiteliali bronchiali (HBE) utilizzando condizioni di interfaccia aria-liquido fornisce un modello utile per studiare i processi di differenziazione cellulare delle vie aeree e la funzione. Negli ultimi anni, l'uso di vettori lentivirali per la consegna transgene diventata pratica comune. Mentre ci sono segnalazioni di trasduzione di cellule epiteliali delle vie aeree completamente differenziate con alcuni lentivirus pseudo-digitato non-HIV, l'efficienza complessiva di trasduzione è di solito inferiore al 15%. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per produrre lentivirus e di trasdurre cellule epiteliali bronchiali umane primarie. Usando cellule epiteliali bronchiali indifferenziate, trasduzione in terreni di crescita epiteliale bronchiale, mentre le cellule attaccano, con una molteplicità di infezione di fattore 4 fornisce efficienze vicino al 100%. Questo protocollo descrive, passo dopo passo, la preparazione e la concentrazione di vettori lentivirali alto titolo e esimoprocesso di trasduzione e. Si discute gli esperimenti che hanno determinato le condizioni di coltura ottimali per raggiungere trasduzione altamente efficienti di cellule epiteliali bronchiali umane primarie.
Introduction
Lo sviluppo di replica-difettose, lentivirus pseudotyped (LV) ha fornito ai ricercatori un metodo sicuro ed efficace per fornire transgeni in vitro 1. Grazie alla loro espressione a lungo termine, questi LV potrebbe essere utilizzato anche per l'erogazione di agenti terapeutici in vivo 2,3. La produzione di LV richiede co-trasfezione di rene embrionali umane (HEK) cellule con diversi plasmidi: vettore di trasferimento, imballaggi gag / pol, imballaggi di giri, e la busta vescicolare glicoproteina virus della stomatite (VSV-G) plasmidi. Sistemi di imballaggio di terza generazione sono considerati più sicuri rispetto ai sistemi di seconda generazione perché il gene rev è codificato su un plasmide confezione separata, riducendo così la possibilità di ricombinazione per produrre un lentivirus competente replica. Anche se i sistemi di confezionamento di seconda generazione producono cinque unità di trasduzione totali superiori piega, la scissione del genoma virale originale per creareil sistema di terza generazione ha diminuito il livello di trasduzione solo minimamente 3,4.
Mentre le linee cellulari possono essere trasdotte più semplice ed efficiente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per le cellule primarie, perché questi sono più rappresentativi di tessuti in vivo 5,6. Tuttavia, le cellule principali sono refrattari alla trasduzione. Mentre sono stati segnalati trasduzione di cellule delle vie aeree epiteliale completamente differenziate, l'efficienza complessiva non sia superiore al 15% 7.
Qui descritto è un protocollo che permette la produzione di LV alto titolo. Un approccio step-by-step è delineato per raggiungere quasi il 100% di efficienza di trasduzione in cellule HBE primarie. Più specificamente, il protocollo descrive le condizioni di coltura ottimali strumentali per riuscire 3. In breve, le cellule 293T HEK sono trasfettate utilizzando il lentivirale pCDH vettore di espressione con il EF-1 promotore di espressione di guida di una maggiore verde fluorescenteproteine (eGFP) o mCherry, una proteina fluorescente rossa, e un sistema di confezionamento di terza generazione. LV rilasciate in media sono raccolti 24-72 ore più tardi. Le particelle virali sono concentrati con polietilene glicole (PEG), un metodo conveniente e facile della concentrazione virale, prima stima titolo utilizzando un kit di p24 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Successivamente, le cellule HBE primarie indifferenziate sono trasdotti in mezzi proliferazione (terreno di crescita epiteliale bronchiale o BEGM) 8, mentre si collega (dopo essere tripsinizzati), ad una molteplicità di infezione (MOI) fattore 4, aggiungendo hexadimethrine bromuro e incubando per 16 ore ( durante la notte). Le cellule sono poi lasciati differenziare. Poiché il transgene è espresso virale a lungo termine (utilizzando il promotore appropriato, vedere la discussione), espressione verrà mantenuta per tutto differenziazione in un epitelio delle vie aeree pseudostratificato o può essere indotta (utilizzando un promotore inducibile) dopo la differenziazione.
<p class = "jove_content"> Questo protocollo è di grande interesse per i ricercatori che desiderano utilizzare le cellule HBE primarie, invece di linee cellulari, e potrebbe essere adattabile ad altri difficili da trasdurre tipi di cellule.Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui delineato assicura quasi il 100% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, ci sono passaggi durante il processo che sono importanti per raggiungere questo obiettivo. Per esempio, durante il processo di trasfezione, la presenza di precipitati nel mix trasduzione (drop) o nel piatto il giorno dopo trasduzione (figure 1b e d) sono entrambi rilevanti per una buona trasfezione. L'assenza di un precipitato o la presenza di agglomerati può essere dovuto ad una omissione di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l'Alleanza Organo Agenzia Recupero Vita dell'Università di Miami per la fornitura di polmoni. Ringraziamo anche il Dr. Lisa Künzi per la preparazione del DNA usato per gli esperimenti mostrati nella Figura 2B e 3-D, il Dr. Ben Gerovac e Lisa Novak per il virus mCherry utilizzato per gli esperimenti nelle figure 3A a C. Ringraziamo anche Gabriel Gaidosh dalla struttura di imaging, Dipartimento di Oftalmologia presso l'Università di Miami.
Questo studio è stato sponsorizzato da finanziamenti del NIH, la Fondazione CF e l'assistente di volo Medical Research Institute di Dr. Matthias Salathe.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
Referências
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