마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포
Summary
Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.
Abstract
대 식세포와 수지상 세포 (DC가)는 병원균에 대한 방어에 중요한 역할을 담당 조직과 림프 기관에서 발견되는 선천성 면역 세포이다. 그러나 따라서, 시험 관내 모델이 개발되었으며, 자세하게 공부 충분한 수의 분리하기가 어렵다. 골수 유래 대 식세포 및 수상 세포의 체외 배양 면역 연구 노포 가치있는 방법이다. 여기서, 배양 및 사이토킨 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용하여 기본 마우스 골수 세포의 단일 배양액으로부터 수지상 세포 및 대식 세포를 모두 식별하기위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 제 루츠 동부 등에 의해 개발 된 기존의 방법에 기초한다. 골수 유래 수지상에 대한 1천9백99인치 문화는 이질적이며, MHCII 및 형광 표지 히알루 론산 (FL-HA)의 미성숙과 성숙 수지상 세포에서 대 식세포를 구분하는 데 사용됩니다. 이러한 GM-CSF는 유래 대 식세포 프로밀접하게 표현형과 기능 모두에서 폐포 대 식세포 유사 체외 파생 된 대 식세포의 편리한 소스를 제공해 줄.
Introduction
몇몇 시험 관내 배양 방법은 골수 유래 대 식세포 (BMDMs) 및 하나 이상의 성장 인자의 조합을 사용하여 골수 – 유래 수지상 세포 (BMDCs)를 생성하기 위해 설명되었다. BMDMs는 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 또는 GM-CSF, 2를 사용하여 골수 세포를 배양하여 생성 될 수있다. BMDCs를 들어, 골수 문화 FLT3 리간드의 추가 (B220 + 각각의 CD11c 높은 / MHCII 높이의 CD11c 보라)을 문화 3,4 9 일 후 비 부착 클래식 형질 수지상을 발생시킨다. 대조적으로, 비 – 부착 세포는 GM-CSF 단독 5,6- 함께 배양 7 내지 10 일 후에 생성, GM-CSF 및 IL-4 7 또는 GM-CSF 및 FLT3 리간드 8,9 BMDCs 더 자세히 염증성 수지상 닮은 생성 (중 CD11c 높은, MHCII 높은 CD11b를 +) 10. 이러한 시험 관내 배양 물 식세포를 생성하는데 사용되는 동안 또는각각의 문화는 순수한 인구를 초래하는 경우 DC가, 그것은 명확하지 않다. 예를 들면, GM-CSF에 부착 배양 세포가 동질 및 관찰 가변성 인 추정 식세포 5 수지상 6,11-13로 사용되는 것과 동일한 배양에서 비 부착 세포 인 것으로 설명되었지만 때문에 개발 14, 15의 다른 단계에. 또한, 연구는 생체 16,17 폐포 대 식세포 현상에 필수적인 성장 인자로 GM-CSF를 발견하고, 폐포 대 식세포 16,17,18 형상을 생성하는 시험 관내에서 사용될 수있다.
접착 이외에, GM-CSF 치료 골수 배양에서 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하기위한 절차는 GM-CSF 골수 배양 물 내에 존재하는 이질성 제안 매우 유사하다. 이것은 참으로이 논문은 BMDC 문화의 비 접착 부분에 BMDMs의 존재를보고 같은 경우 것으로 보인다. 한 논문에서, 그들은 identifiED 가장 밀접 폐포 대 식세포를 닮은 및 T 세포 (19)를 활성화하기 위해 환원 능력을 가진 유전자 발현 특성을 발현하는 CD11c +를,는 CD11b +, MHCII 미드, MerTK + 및 CD115 +와 같은 세포 집단. MHCII 및 FL-HA 사용되는 두 번째 종이는 폐포 대 식세포와 같은 인구를 식별하는 (중 CD11c +를, MHCII 중간 / 낮음, FL-HA 고) 미숙 구별했다 (중 CD11c +를, MHCII 중반, FL-HA 낮음) 성숙 DC가 (중 CD11c +를, MHCII 고), 모두 표현형 및 기능 18. 이 논문 모두는 대 식세포와 BMDC 문화에서 데이터를 해석 할 때주의해야 그 치료를 나타내는 DC 인구를 모두 포함, GM-CSF BMDC 문화가 이질적인 것을 보여줍니다.
이 프로토콜은 골수, GM-CSF에서 배양 골수 세포를 분리하고, 폐포 대 식세포 등을 식별하는 방법을 설명바인딩 및 MHCII 식 FL-HA를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 골수 문화의 미성숙과 성숙 수지상에서 인구. .이 절차는 루츠 등 (6)의 설정 순서에 기초하여, 5 생성 할 수있다 – 10 ㎖의 배양 7 일째에 10 × 106 비 – 부착 세포. 문화는 일에서 7 ~ 10에 사용할 수 하루 7이 성장하고 대량으로 체외 폐포와 같은 식세포를 분리하는 간단한 방법을 제공에서 대 식세포, 미성숙과 성숙 수지상뿐만 아니라 일부 전구 세포의 이종 인구를 산출한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서는 루츠 외. (6)로부터 구성되는 단일 마우스 골수 배양 물에서 GM-CSF 유도 된 대 식세포 및 수지상 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 이 문화의 미성숙 수지상 세포와 대 식세포을 구별 결합 MHCII 표현과 FL-HA 이전에 곤란 하였다 (그림 3C 참조). 이것은, 함께 Helft 등. (19)에 의해 다른 보고서로, 이전에는 수지상 것으로 생각되었다 GM-CSF 유도 BMDC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 연구 (CIHR) (교부금 MOP-119503)과 캐나다의 자연 과학 및 공학위원회 (NSERC)의 캐나다 연구소에 의해 투자되었다. NSERC도 YD하는 여름 studentships을 지원 AA YD는 4 년 교제 수상 브리티시 컬럼비아 대학 (UBC)에서 지원, AA는 대학원생의 석사 수상 (CGS-M)와 CIHR에 의해 지원됩니다. 우리는 그림 2의 이미지를 생성하는 데 사용되는 현미경으로 지원 캘빈 Roskelley 감사합니다. 우리는 또한 UBC 동물 및 유동 세포 계측법 시설의 지원을 인정합니다.
Materials
| Flow Cytometer | BD | LSR-II | |
| Automated Inverted Microscope | Leica | DMI4000 B | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-425-600 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| 26 1/2 Gauge Needle | BD | 305111 | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 357070 | *Falcon brand |
| Eppendorf tubes (1.5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml polystyrene round bottomed tubes | Corning | 352052 | |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | *Various | *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep |
| Hemocytometer | Richert | 1490 | |
| Sterile 100 x 15 mm Petri Dish | Corning | 351029 | *Falcon brand |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Ammonium Chloride | BDH | BDH0208-500G | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher | 14175-095 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | BDH | BDH0268-500G | |
| Potassium Chloride | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Rooster Comb Sodium Hyaluronate | Sigma | H5388-1G | *Used to make fluoresceinated hyaluronan |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 21870-076 | No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using. |
| Sodium Chloride | Fisher | 5271-10 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | 50876-1Kg | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant | N/A | N/A | Clone: 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone: N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone: M5/114.15.2 |
| Biotinylated Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | Goat polyclonal IgG |
| Streptavidin PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-5MG |
Referências
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
- Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis–complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
- Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
- Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
- Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a ‘phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
- Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
- Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
- de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
- Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: ‘Exhausted’ or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
- Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
- Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
- Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).
