骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
ヒトおよびマウスのT細胞受容体（TCR）のレパートリーは、1×10 8および2×10 6個のユニークなTCRをそれぞれ1,2と推定されています。この大きな多様性は、T細胞が自己ペプチドから、ならびに抗原提示細胞（APC）上の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）により提示される病原体由来の抗原エピトープの広大な配列を認識することができます。ユニークなペプチド – MHC複合体とTCRの相互作用の微妙な違いは、T細胞がアポトーシス、アネルギー、活性化、分化、サイトカイン産生や細胞毒性を受けるかどうかを決定します。しかし、大規模なTCRレパートリーに、特定のTCRは、特定の抗原に反応するかの分析は、単一のTCRのシステムを使用する必要があります。
様々なTCRトランスジェニックマウスは、in vivoモデル3-9で単一のTCRの機能を研究するために生成されています。しかし、を含むトランスジェニックマウスをTCRする注意点がありますコスト、単一のトランスジェニックマウスおよび生殖細胞系列DNA 10にランダムな導入遺伝子挿入のいわゆる創始者効果を生成するための時間の長さ。そのため、比較的少数のTCRトランスジェニックマウスは、任意の所与の抗原に対して生成されており、同じエピトープのための高および低TCRの親和性の機能的な意味はほとんど対処されていません。画面への迅速なアプローチの必要性に対処し、個別にまたは組み合わせて、複数のTCRを研究するために、retrogenic（レトロウイルスから「レトロ」およびトランスジェニックから「ジェニック」）マウスは、トランスジェニックマウス11-13を TCRするための代替として利用されてきました。
いくつかのウイルスの中に見つかった2Aペプチドのコンセンサスモチーフは、切断は2Aのグリシンおよび2Bのプロリンとの間で発生する、2A-ASP-ヴァル/イルGLUT-X-ASN-プロのGly-2B-プロで構成されシス -acting加水分解酵素活性から、翻訳10,14-16間にリボソームスキップが生じます。 Cを描いた詳細図については様々な2Aペプチド（F2A、E2A、T2AとP2A）のleavage参照10を参照してください – このように12、2シストロン（TCRαおよびTCRベータ）は、単一のベクター中の化学量論的な翻訳結果としてリンクすることができます。このアプローチを利用して、我々が発現し、in vivoで直接複数の抗原特異的TCRを比較することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
最適な骨髄健康、導入効率および再構成を確保するためのプロトコルでは、我々の詳細のいくつかの重要なステップ。最初の重要なステップが発生し、GP + E86ウイルス産生細胞の適切なメンテナンスです。使用初期継代のプロデューサー細胞株、使用前に80％の密集度以下に維持します。 48時間 – 新鮮GP + E86ウイルスプロデューサー細胞を作製すると、293T細胞は、継代早期および24のために文?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、JDRF 1-FAC-2014から243-AN APF、ADA、BCMにおける糖尿病研究センター（P30-DK079638）のパイロット/フィージビリティプログラム、MLBにNIH（5K22A1119151-01と1R56DK104903-01）からの助成金によってサポートされていました1-15-JF-07、MBに免疫フェローシップ、およびロバートとジャニス・マクネア財団でAAI採用。
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
Referências
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