Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Resumo

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Resumo

Em geral, a adesão de células T é um componente crítico da função, contribuir para os processos distintos de recrutamento celular para os locais de inflamação e a interacção com as células apresentadoras de antigénio (APC), na formação de sinapses imunológicas. Estes dois contextos de adesão celular T diferem em que T interações célula-APC pode ser considerado estático, enquanto interações dos vasos células T no sangue são desafiados pela tensão de cisalhamento gerada pela própria circulação. interacções célula T-APC são classificados como estático em que os dois parceiros celulares são estáticos em relação ao outro. Normalmente, esta interacção ocorre dentro dos nódulos linfáticos. Como uma célula T interage com a parede do vaso sanguíneo, as células de prender e devem resistir à tensão de cisalhamento gerada. ^1,2 Estas diferenças evidenciam a necessidade de compreender melhor a aderência estática e a aderência em condições de escoamento como dois processos reguladores distintos. A regulação da adesão das células T pode ser sucintamente descrito como conpesca à linha do estado de afinidade de integrina moléculas expressas na superfície da célula, e regulando assim a interacção de integrinas com os ligandos da molécula de adesão expressas na superfície da célula que interage. A nossa compreensão atual da regulação dos estados afinidade para a integrina vem muitas vezes simplista em sistemas modelo in vitro. O ensaio de adesão usando condições de fluxo descritos aqui permite a visualização e a quantificação precisa de interacções celulares de células-T epitelial em tempo real, na sequência de um estímulo. Uma adesão sujeito ao ensaio de fluxo pode ser aplicado a estudos de adesão de sinalização nas células T, após o tratamento com substâncias inibidoras ou estimuladores. Além disso, este ensaio pode ser expandido para além de sinalização de células T para qualquer população de leucócitos adesivo e qualquer integrina-molécula de adesão par.

Introdução

T medeia a adesão de linfócitos de um número de processos diferentes, em um sistema imunitário saudável, ³ desempenhando papéis críticos no tráfico de células T e a apresentação do antigénio. Se durante a vigilância imunitária ou uma resposta imunitária activa estas duas grandes funções de adesão são críticos. ⁴ Os eventos de sinalização fisiológicos de interacções de células de células do endotélio T são distintos de células T-célula que apresenta antigénios (APC) interacções, e, portanto, requerem métodos distintos de estudo para melhor compreender as cascatas de sinalização envolvidos. A adesão firme de uma célula T a uma parede do vaso sangu....

Protocolo

1. plaqueamento das células CHO-ICAM

Nota: O objectivo deste passo é a chapear as células CHO-ICAM nas câmaras de fluxo para o crescimento durante a noite com o objectivo de gerar uma monocamada confluente.

1. Manter as células CHO-ICAM em 10 cm de cultura de tecidos tratados pratos de cultura de 10 ml de meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM meio de cultura completo) a 37 ° C com 5% CO _2.
2. Para recolher as células, adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina-EDTA e incubar à temperatura ambiente durante 1 min com agitação suave. Neutraliza-se a tripsina com 4 ml de meio. ....

Resultados

Os resultados representativos são apresentados a partir do ensaio de adesão de Jurkat e de fluxo utilizando células T CD3 ⁺ humanos primária, tal como indicado, estimuladas com SDF-1α. Os controlos negativos em todas as experiências mostradas são células não estimuladas. Um limiar basal percentagem de adesão das células não estimuladas é entre 5 - 10%; adesão de base notadamente acima dessa faixa indica uma experiência problemática e sugere a população início de células T fora.......

Discussão

A fim de analisar adequadamente a adesão de células T, o estimulante seja incluída no estudo deve ser considerado na escolha de um método in vitro. Embora existam vários ensaios para estudar os sinais que conduzem a LFA-1 e ICAM-activação uma ligação todos os métodos não são intercambiáveis. Um ensaio de adesão estático ¹⁰ é o mais adequado para estudar as interações de células T-APC; Alternativamente, o método de tensão de corte detalhado aqui é ideal para modelar as interacções das células de célul.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Amostras de células T (linha celular ou primária)	ATCC	TIB-152	Células T humanas periféricas
Células CHO-ICAM-1	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
Frasco de vidro de 500 ml	Fisher	FB800500
Frasco de vidro de 250 ml	Fisher	FB800250
Silicone tubulação 0,8 mm	ibidi	10841
Microscópio confocal com câmara de incubadora	Ziess	700	Qualquer microscópio fluorescente de campo amplo
Bomba de seringa	New Era Pump Systems	NE-300
Seringa de 60 ml	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R& D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Microcentrífuga Lonza	17-516F
	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Software Volocity	Perkin Elmer	Versão 6.2.1
Software ImageJ	NIH	Versão 1.48V
Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos	Falcon	353003
Tripsina-EDTA (0,25%) Vermelho de fenol	Gibco	25200114
FBS inativado por calor	Denville	FB5001-H
Penicilina / Estreptomicina	Fisher	BP295950