Analys av vidhäftning under Shear stress för studier av T-lymfocyter-adhesionsmolekyl interaktioner

Summary

Denna vidhäftningsflödesanalys ger en enkel, hög modell av T-cell-epitelceller interaktioner inverkan. En sprutpump används för att generera skjuvspänning, och konfokal mikroskopi fångar bilder för kvantifiering. Målet med dessa studier är att på ett effektivt sätt kvantifiera T-cell adhesion med hjälp av flödesförhållanden.

Abstract

Totalt sett är T-cell-adhesion en kritisk komponent i funktion, vilket bidrar till de distinkta processer av cellrekrytering till inflammationsställen och interaktion med antigenpresenterande celler (APC) i bildandet av immunologiska synapser. Dessa två sammanhang av T-cell adhesion skiljer sig genom att T-cell-APC interaktioner kan anses statisk, medan T-cell-blodkärls interaktioner utmanas av skjuvspänningen som genereras av cirkulation själv. T-cell-APC-interaktioner klassificeras som statisk eftersom de två cellulära partners är statiska i förhållande till varandra. Vanligtvis sker denna växelverkan inom lymfkörtlarna. Som en T-cell samverkar med blodkärlsväggen, cellerna gripa och måste motstå den genererade skjuvspänningen. ^1,2 Dessa skillnader understryker behovet av att bättre förstå statisk vidhäftning och vidhäftning under flödesförhållanden som två skilda regulatoriska processer. Regleringen av T-cell adhesion kan de flesta kortfattat beskrivas som controlling affinitetstillstånd grin molekyler som uttrycks på cellytan, och därmed reglera interaktionen av integriner med adhesionsmolekylen-ligander som uttrycks på ytan av det samverkande cellen. Vår nuvarande förståelse av regleringen av integrin affinitetstillstånd kommer från ofta förenklad i modell vitro-system. Analysen av vidhäftning med användning av flödesförhållanden som beskrivs här gör det möjligt för visualisering och noggrann kvantifiering av T-cell-epitelial cell-interaktioner i realtid efter ett stimulus. En adhesion under analys flöde kan tillämpas på studier av vidhäftning signalerings inom T-celler efter behandling med hämmande eller stimulerande ämnen. Dessutom kan denna analys utvidgas bortom T-cell-signalering till varje vidhäftande leukocytpopulation och varje grin-adhesionsmolekyl paret.

Introduction

T-lymfocyter vidhäftning förmedlar ett antal distinkta processer i ett friskt immunsystem, ^tre spela kritiska roller i T-cell trafficking och antigenpresentation. Huruvida under immunövervakning eller ett aktivt immunsvar dessa två breda roller för vidhäftning är kritiska. ⁴ De fysiologiska signaleringshändelser av T-cell-endoteliala cellinteraktioner är distinkta från T-cell-antigenpresenterande cell (APC) interaktioner, och därför kräver olika metoder för studie för att bäst förstå signaleringskaskader inblandade. Företaget vidhäftning av en T-cell till en blodkärlsvägg under lymfocyter extravasering kräver snabb och dynamisk grin aktivering. Den snäva växelverkan mellan ett aktivt tillstånd grin och adhesionsmolekyler längs endotelet leder till vidhäftning resistent mot flödet av blod, vilket gör att T-celler att krypa längs ytan på jakt efter ett område tillåtande till cellpassage. ⁵ för genomsökning av en T-cell bi -directionally alonga blodkärlsväggen är beroende av polariserade adhesion, med en distinkt adhesiv främre änden av den T-cellen. ⁶ Viktigast starka adhesion och migration kräver motstånd mot skjuvkraft som alstras genom att cirkulera blodflödet.

Vid utformningen av experiment för att studera lymfocytadhesion bör uppmärksamhet ägnas åt den specifika stimulansen av intresse. Medan integrinaktivering är en vanlig och viktig del av alla former av T-cell adhesion, kaskader av aktivering kommer sannolikt att vara unik nedströms individuella receptorer och co-receptorer. Likaså integrin och adhesionsmolekyl par fungerar i specialiserade mikromiljöer och på specifika subpopulationer. På detta sätt kan dessa par regleras helt annorlunda. Den modell som presenteras här är idealisk för att studera signaleringskaskader som leder till integrinaktivering sker under skjuvspänning förhållanden. ⁷ Dessa interaktioner kan inte förstås tillräckligt i en statisk adhesipå systemet på grund av effekterna dessa krafter har visat sig ha direkt på T-cellbeteende. ⁸ Även presenteras här med T-celler och CHO (Chinese Hamster Ovary) celler manipulerade att uttrycka human ICAM-1 (CHO-ICAM-celler) Systemet kan lätt modifieras för att studera olika leukocytpopulationer eller adhesionsmolekyler.

Denna analys tillhandahåller en metod för att kvantifiera T-cellvidhäftningsförmåga och integrin-aktivering med hjälp av skjuvspänning, vilket ger en modell för fast vidhäftning skede av leukocyter extravasering. Genom användning av CHO-ICAM-celler kan undersökas affiniteten hos LFA-1 för sin ligand i levande celler i realtid som svar på olika stimuli av intresse. Denna teknik kräver lätt erhållas, kommersiellt tillgängliga mikroflödeskammare i kombination med en sprutpump, kraftigt förenkla den utrustning som krävs för att modellera blodflödet och skjuvning stress jämfört med andra modeller. ⁹ En annan stor fördel med denna analys är att specifika signaleringskaskader och den resulterande aktiveringstillstånd enskilda integriner kan rent studeras genom användning av konstruerade CHO-celler som uttrycker humana adhesionsmolekyler av intresse. Dessutom är kombinationen av kvantitativa data med levande cell imaging en betydande fördel med denna metod. Sammantaget medan ett antal analyser av statisk T-cell adhesion har beskrivits som fint modell T-cell-APC-interaktioner, dessa modeller är otillräckliga i att fånga den dynamiska processen för T-cell-epitelial vidhäftning. Av denna anledning, när man väljer ett vidhäftningsanalysen stimulans i fråga måste övervägas.

Protocol

1. Plating CHO-ICAM-celler Obs: Målet med detta steg är att plätera de CHO-ICAM-celler i flödeskamrarna för tillväxt över natten med målsättningen att generera ett sammanflytande monoskikt. Upprätthålla CHO-ICAM-celler i 10 cm vävnadsodlingsbehandlade odlingsskålar i 10 ml RPMI-medium som kompletterats med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (CHO-ICAM komplett odlingsmedium) vid 37 ° C med 5% CO 2. Att samla upp celler, tillsätt 1 ml 0,5% …

Representative Results

Representativa resultat visas från vidhäftningsflödesanalys med användning av Jurkat och primära humana CD3 + T-celler, såsom anges, stimulerades med SDF-1α. De negativa kontrollerna i alla experiment som visas är ostimulerade celler. En tröskel basal procent adhesion av ostimulerade celler är mellan 5-10%; bas adhesion särskilt över detta område indikerar en problematisk experiment och föreslår start populationen av T-celler ospecifikt föraktiverad under utarb…

Discussion

För att kunna analysera T-cell adhesion, till stimulerande ingå i studien måste beaktas när man väljer en in vitro-metod. Medan det finns flera analyser för att studera signaler som leder till LFA-1-aktivering och ICAM-1-bindning alla metoder är inte utbytbara. En statisk vidhäftningsanalys ¹⁰ är bäst lämpad för att studera T-cell-APC interaktioner; alternativt, är skjuvspänningen metoden beskriven här idealiskt för att modellera T-cell-epitelceller interaktioner. In vivo, so…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950