Le diméthylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Modèle chez le rat
Summary
We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.
Abstract
Quatre à six semaines vieux rats mâles Wistar ont été utilisés pour produire des modèles animaux de fibrose du foie. Le processus nécessite quatre semaines d'administration de 10 mg / kg diméthylnitrosamine (DMN), étant donné intrapéritonéale pendant trois jours consécutifs par semaine. injections intra-péritonéales ont été effectuées dans la hotte comme DMN est un hépatotoxine et cancérigène connu. Ce modèle présente plusieurs avantages. Tout d'abord, les changements du foie peuvent être étudiés de manière séquentielle ou à des étapes particulières d'intérêt. Deuxièmement, le stade de la maladie du foie peut être contrôlée par la mesure de sérum alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST) enzymes. En troisième lieu, la gravité des dommages au foie à différents stades peut être confirmé par le sacrifice des animaux à des moments désignés, suivie d'un examen histologique des tissus du foie Trichome tachés de Masson. Après quatre semaines de DMN dosage, le score typique de la fibrose est de 5 à 6 sur l'échelle Ishak. Le modèle peut être reproduit de manière cohérente et a étélargement utilisé pour évaluer l'efficacité d'agents anti-fibrotiques potentiels.
Introduction
DMN est une toxine spécifique du foie puissant. Son métabolisme, la distribution tissulaire, et la capacité de causer des blessures aux foies de rats a été signalée par Magee 1, et le mécanisme des dommages des hépatocytes et la mort cellulaire par apoptose a été décrit par Pritchard et Butler 2. L' administration intermittente de ce composé a été rapporté pour induire une fibrose du foie chez les chiens et les rats 3,4.
Les mécanismes et des changements morphologiques de la fibrose hépatique ont été largement étudiés en utilisant ce modèle. Dans les premières études utilisant le rat, le traitement de 3 semaines avec DMN produit une nécrose hémorragique centro – lobulaire suivie d' une cirrhose micronodulaire sans stéatose 5. Il a été montré que la fibrose précoce, le collagène formé est de plus réticulé de type III étant plus important que le type I 6. En commun avec d'autres causes, des changements fibrotiques induite DMN-ont été associés à une augmentation des cellules Kupffer; les macrophages hépatiques qui résident in sinusoïdes. Ces cellules se transforment en myofibroblastes et produisent des quantités excessives de matrice extracellulaire qui est le principal problème de la fibrose 7.
En ce qui concerne la signalisation cellulaire, Nakamura et al. , Ont démontré que le TGF-β joue un rôle critique dans la progression de la fibrose hépatique 8. Ils ont utilisé un adénovirus exprimant un récepteur de TGF-β tronqué de type II, d'inhiber spécifiquement la signalisation du TGF-β. La fibrose hépatique chez ces rats a été interrompue de manière spectaculaire au cours du traitement de DMN par rapport aux groupes témoins. D' autres études ont confirmé que la suppression du TGF-β conduit à la réduction du foie le développement de la fibrose 9,10. Le modèle a également été utilisé dans une étude globale de profilage génétique pour identifier d' autres marqueurs de fibrose et de protéines qui pourraient être utilisés comme cibles de médicaments pour la thérapie anti-fibrotique 11.
D'autres agents chimiques utilisés pour induire une fibrose du foie comprennent thioacétamide (TAA) et ctétrachlorure arbon (CCl 4). TAA a été utilisé pour la première chez les rats et plus tard chez les souris 12. Les avantages de ce modèle comprennent: la facilité d'administration de produits chimiques dans l'eau, la reproductibilité du modèle avec la cirrhose micronodulaire caractéristique et les modifications biochimiques de boisson. Les inconvénients comprennent: la période de 3 mois pour la fibrose hépatique de longue date pour développer et le manque de compréhension du mécanisme moléculaire pour l'induction de la fibrose hépatique. Quant à CCl 4, son utilisation a diminué pour les raisons suivantes: il ne reproduit pas la maladie de foie humain, a des effets nocifs sur la couche d'ozone, provoque la douleur et la détresse des animaux, est très toxique pour les humains et nécessite des précautions supplémentaires dans sa manipulation et élimination 13,14.
Prolongée des voies biliaires obstruction (par une intervention chirurgicale) comme modèle expérimental pour la cirrhose du foie a été rapporté par Kountouras et al. 15. Cette méthode est non toxique pour les humains et les animaux. Houtefois, le temps nécessaire pour que la fibrose du foie pour développer varie. Un examen de 30 rapports par Marques et al. 16, a constaté qu'il a fallu de sept jours à quatre semaines après la chirurgie de la fibrose du foie à se développer. Les changements pathologiques décrites ressemblent à ceux de la fibrose biliaire chronique humaine et le modèle serait plus adapté pour les chercheurs intéressés dans ce domaine.
En résumé, l'administration intermittente d'une dose constante de DMN chez le rat de plus de 4 semaines produit une fibrose hépatique qui imite la maladie humaine. Rats traités montrent le développement progressif des lésions du foie et la fibrose parenchymateuse 4,17. Progression de la maladie et la gravité peuvent être contrôlés par l' intermédiaire d' échantillons de sang ou sacrifice des animaux à des moments spécifiques et l'effet est hautement reproductible 18. Ainsi , le modèle a été largement utilisé pour étudier les mécanismes de la fibrose hépatique et de la cirrhose, ainsi que pour cribler des agents potentiels anti-fibrotiques 10,19,20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit un procédé pour rendre un modèle animal de la fibrose hépatique et d'évaluer la gravité de la fibrose hépatique. Il est important de délivrer la dose correcte de DMN et respecter le calendrier des injections intraperitoneales hebdomadaires. Comme l'expérience progresse, il est essentiel de peser les rats et recalculer la dose au début de chaque semaine des injections de DMN. Gardez à l'esprit que DMN est toxique et doit être manipulé dans l'armoire de fumées. Nous effectu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.
Materials
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
Referências
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