Rat Dimethylnitrosamine Başlatılan Karaciğer Fibrozis Modeli
Summary
We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.
Abstract
Dört eski bir hafta altı, erkek Wistar sıçanlar karaciğer fibrozis hayvan modelleri üretmek için kullanıldı. işlem, haftada üç gün boyunca intraperitonal olarak verilen 10 mg / kg dimethylnitrosamine (DMN) verilmesinden sonra dört hafta gerektirir. DMN bilinen hepatoxin ve kanserojen olduğu gibi intraperitonal enjeksiyon davlumbaz yapıldı. modeli birçok avantajı vardır. İlk olarak, karaciğer değişiklikleri ardışık olarak veya ilgi konusu özel aşamalarında incelenebilir. İkinci olarak, karaciğer hastalığı aşaması serum alanin aminotransferaz (ALT) ve aspartat aminotransferaz (AST) enzim ölçümü ile takip edilebilir. Üçüncü olarak, farklı aşamalarda karaciğer hasarının şiddeti Masson diken lekeli karaciğer dokularının histolojik inceleme ardından belirlenen zaman noktalarında hayvanların kurban tarafından teyit edilebilir. DMN dört haftalık dozajlama sonrasında tipik fibroz skoru 5 Ishak ölçekte 6 etmektir. Model sürekli olarak yeniden olabilir ve olmuşturyaygın potansiyel anti-fibrotik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.
Introduction
DMN güçlü bir karaciğere özgü bir toksindir. Sıçanların karaciğerlerinde yaralanmasına neden olan metabolizma, doku dağılımı ve yetenek Magee 1 tarafından rapor edildi ve apoptoz ile hepatosit hasarı ve hücre ölümü mekanizması Pritchard ve Butler 2 tarafından tarif edilmiştir. Bu bileşiğin aralıklı idaresi için köpekler ve fareler 3,4 karaciğer fibrozu indüklediği rapor edilmiştir.
mekanizmaları ve karaciğer fibroz morfolojik değişiklikler yaygın bu modeli kullanarak incelenmiştir. Sıçan kullanarak erken çalışmalarda, DMN ile 3 haftalık tedavi steatoz 5 olmadan mikronodüler siroz ardından sentrilobuler hemorajik nekroz üretti. Erken fibrozis olduğu gösterilmiştir, oluşan kollajen daha fazla çapraz tip I 6 daha belirgin olmak tip III bağlantılı idi. Diğer nedenler ile ortak olarak, DMN kaynaklı fibrotik değişiklikler Kupffer hücrelerinde bir artış ile ilişkili olduğunu; i ikamet karaciğer makrofajlarn sinüzoidlerinde. Bu hücreler miyofibroblastlar içine morph ve fibrozis 7 birincil sorundur hücre dışı matriks aşırı miktarda üretir.
Hücresel sinyal açısından, Nakamura ve ark., TGF-β karaciğer fibrozu 8 ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Özel olarak, TGF-β sinyalini inhibe etmek için bir tepe bölümü kesik tip II TGF-β reseptörünü sentezleyen bir adenovirüs kullanılan. kontrol grubuna kıyasla bu sıçanlarda karaciğer fibroz olağanüstü DMN tedavisi sırasında durduruldu. Diğer çalışmalar TGF-ß bastırılması karaciğer fibroz gelişimi 9,10 azaltılmasına yol açtığını doğruladı. Model, aynı zamanda anti-fibrotik tedavi 11 ilaç hedefleri olarak kullanılabilecek diğer fibroz belirteçleri ve proteinleri belirlemek için genel bir gen profili çalışmada kullanılmıştır.
Diğer kimyasal maddeler arasında tiyoasetamid (TAA) ve C karaciğer fibrozu uyarılması için kullanılanarbon tetraklorür (CCl4). TAA sıçanlarda ve daha sonra fareler 12 birinci kullanıldı. Bu modelin avantajları şunlardır: Kimyasal yönetim kolaylığı suyu, karakteristik mikronodüler siroz ve biyokimyasal değişiklikler ile modelin tekrarlanabilirliği içme. sakıncaları şunlardır: karaciğer fibrozu için 3 aylık uzun süre geliştirmek ve karaciğer fibrozis indüksiyonu için moleküler mekanizmasının anlaşılması eksikliği için. CCl4 gelince, kullanımı aşağıdaki nedenlerle azalmıştır: insan karaciğer hastalığı taklit değil, ozon tabakası üzerinde zararlı etkileri vardır hayvanlara acı ve sıkıntı neden olur, insanlar için çok toksiktir ve kullanımı konusunda ek önlemler gerektirir ve bertaraf 13,14.
Karaciğer sirozu için deneysel bir model olarak (cerrahi müdahale ile) Uzun süreli safra kanalı tıkanıklığı ilk Kountouras ve ark., 15 tarafından rapor edilmiştir. Bu yöntem, insan ve hayvanlar için toksik olan. However geliştirilmesi karaciğer fibrozu için gerekli süre arasında değişir. Marques ve arkadaşları. 16 ile 30 raporların bir yorum, karaciğer fibroz geliştirmek için ameliyattan sonra dört hafta yedi gün sürdü bulundu. açıklanan patolojik değişiklikler insan kronik safra fibrozis taklit ve model bu alanda ilgilenen araştırmacılar için daha uygun olacaktır.
Özetle, 4 hafta boyunca farede DMN sabit bir doz aralıklı idaresi, insan hastalığı taklit karaciğer fibrozu üretir. Uygulanan farelerde karaciğer hasarı ve parankimal fibrozis 4,17 progresif gelişim gösterirler. Hastalığın ilerlemesi ve şiddeti belirli zaman noktalarında kan örneklerinin veya hayvanların kurban aracılığıyla izlenebilir ve etkisi 18 derece tekrarlanabilir. Böylece modeli genel olarak, karaciğer fibrozu ve siroz mekanizmaları incelemek için ve potansiyel anti-fibrotik maddeler 10,19,20 taranması için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz karaciğer fibroz bir hayvan modeli yapmak ve karaciğer fibroz şiddetini değerlendirmek için bir yöntem tanımlanmıştır. DMN doğru doz teslim ve haftalık intraperitoneal enjeksiyon programa uymak önemlidir. Deneme ilerledikçe, o fareler tartmak ve DMN enjeksiyonları her hafta başında dozu yeniden hesaplamak için çok önemlidir. DMN toksik ve duman kabinesinde ele alınması gereken unutmayın. Biz de duman kabinede intraperitoneal gerçekleştirin. Tekrarlanan enjeksiyonlar ihtiyacı ile, enjeksiyon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.
Materials
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
Referências
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis?. Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O’Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant’Anna, L. B., Sant’Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
