De dimethylnitrosamine geïnduceerde leverfibrose Model in het Rat
Summary
We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.
Abstract
Vier tot zes weken oude mannelijke Wistar-ratten werden gebruikt om diermodellen van leverfibrose produceren. De werkwijze vereist vier weken van toediening van 10 mg / kg dimethylnitrosamine (DMN), intraperitoneaal gedurende drie opeenvolgende dagen per week. Intraperitoneale injecties werden uitgevoerd in de zuurkast als DMN is een bekende hepatoxin en kankerverwekkend. Het model heeft verschillende voordelen. Ten eerste kan veranderingen in de lever na elkaar of op bepaalde stadia van belang worden bestudeerd. Ten tweede kan het stadium van leverziekte worden gecontroleerd door het meten van serum alanine aminotransferase (ALT) en aspartaat aminotransferase (AST) enzymen. Ten derde kan de ernst van de schade aan de lever in verschillende fasen worden bevestigd door het offeren van dieren op aangewezen tijdstippen, gevolgd door histologisch onderzoek van Trichome bevlekte lever weefsels Masson. Na vier weken van DMN dosering, de typische fibrosis score is 5-6 op de Ishak schaal. Het model kan consistent worden gereproduceerd en is geweestwijd gebruikt om de efficiëntie van anti-fibrotische geneesmiddelen te beoordelen.
Introduction
DMN is een potente leverspecifieke toxine. Zijn metabolisme, distributie weefsel, en het vermogen om letsel aan lever van ratten werd gemeld door Magee 1, en het mechanisme van hepatocyte schade en celdood door apoptose werd beschreven door Pritchard en Butler 2. Periodieke toediening van deze verbinding werd gemeld leverfibrose bij honden en ratten 3,4 induceren.
De mechanismen en morfologische veranderingen van leverfibrose zijn uitgebreid onderzocht met behulp van dit model. In het begin van studies met behulp van de rat, 3 weken durende behandeling met DMN geproduceerd centrilobulaire hemorragische necrose gevolgd door micronodulaire cirrose zonder steatose 5. Er werd aangetoond dat begin fibrose, het collageen gevormd was verknoopt met type III wordt prominenter dan type I 6. Evenals andere oorzaken werden DMN-geïnduceerde fibrotische veranderingen gepaard met een toename in Kupffer cellen; lever macrofagen dat ik wonenn de sinusoïden. Deze cellen veranderen in myofibroblasten en meer dan normale hoeveelheden extracellulaire matrix die het voornaamste probleem fibrose 7.
In termen van cellulaire signaaltransductie, Nakamura et al. Aangetoond dat TGF-β een cruciale rol in de progressie van leverfibrose 8 speelt. Ze gebruikten een adenovirus een afgeknot type II TGF-β receptor, specifiek remt TGF-β signalering. Leverfibrose bij deze ratten werd spectaculair stopgezet tijdens DMN behandeling in vergelijking met controlegroepen. Andere studies hebben bevestigd dat onderdrukking van TGF-β leidt tot verlichting van leverfibrose ontwikkeling 9,10. Het model werd ook gebruikt in een globale gen profilering studie andere fibrose markers en eiwitten die als drug targets kunnen worden gebruikt voor anti-fibrotische therapie 11 identificeren.
Andere chemische stoffen die worden gebruikt om leverfibrose te induceren omvatten thioaceetamide (TAA) en cArbon tetrachloride (CCl4). TAA werd eerst gebruikt in ratten en later bij muizen 12. Voordelen van dit model zijn: het gemak van chemische toediening in drinkwater, de reproduceerbaarheid van het model met karakteristieke micronodulaire cirrose en biochemische veranderingen. De nadelen zijn: de lange periode van 3 maanden leverfibrose ontwikkelen en het gebrek aan begrip van het moleculaire mechanisme voor de inductie van leverfibrose. Zoals voor CCl4, heeft het gebruik ervan afgenomen om de volgende redenen: het maakt niet leverziekte mens na te bootsen, schadelijke effecten heeft op de ozonlaag, veroorzaakt pijn en leed bij dieren, is zeer giftig voor de mens en vereist extra voorzorgsmaatregelen in de behandeling en verwijdering 13,14.
Langdurige galwegobstructie (door chirurgische interventie) als een experimenteel model voor levercirrose werd voor het eerst gemeld door Kountouras et al. 15. Deze methode is niet toxisch voor mensen en dieren. HHof toevoegde, de tijd die leverfibrose ontwikkelen varieert. Een overzicht van 30 verslagen Marques et al. 16, blijkt dat het duurde zeven dagen tot vier weken na operatie bij leverfibrose ontwikkelen. De pathologische veranderingen beschreven lijken op die van de menselijke chronische biliaire fibrose en het model zou meer geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in dit gebied.
Samengevat, de intermitterende toediening van een constante dosis van DMN in de rat dan 4 weken produceert leverfibrose dat de menselijke ziekte nabootst. Gedoseerde ratten geleidelijke ontwikkeling van leverschade en parenchymale fibrose 4,17. Ziekteprogressie en ernst kunnen worden bewaakt via bloedmonsters of opoffering van dieren op specifieke tijdstippen en het effect is zeer reproduceerbaar 18. Waardoor het model op grote schaal gebruikt om de mechanismen van leverfibrose en cirrose bestuderen en te screenen op potentiële anti- fibrotische middelen 10,19,20.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een werkwijze beschreven om een diermodel van leverfibrose maken en de ernst van leverziekten. Het is belangrijk om de juiste dosis DMN leveren en zich aan het schema van wekelijkse intraperitoneale injecties. Naarmate het experiment vordert, is het cruciaal om de ratten te wegen en opnieuw berekenen van de dosis aan het begin van elke week van DMN injecties. Houd in gedachten dat DMN is giftig en moet in de zuurkast te worden behandeld. Wij voeren de intraperitoneale injecties in de zuurkast ook. De noo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.
Materials
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
Referências
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis?. Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O’Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant’Anna, L. B., Sant’Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
