Observerer Mitotisk divisjon og Dynamics i en Live Sebrafisk Embryo
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
Mitose er avgjørende for organismevekst og differensiering. Prosessen er svært dynamisk og krever beordret hendelser for å oppnå riktig kromatin kondens, microtubule-kinetochore vedlegg, kromosom segregering, og cytokinese i en liten tidsramme. Feil i den delikate prosessen kan føre til sykdom hos mennesker, inkludert fødselsskader og kreft. Tradisjonelle tilnærminger som undersøker humane mitotisk sykdomstilstander er ofte avhengige av cellekultursystemer, som mangler den naturlige fysiologi og utviklings / vev-spesifikk sammenheng fordelaktig når man vil studere human sykdom. Denne protokollen overvinner mange hindringer ved å tilveiebringe en måte å visualisere, med høy oppløsning, kromosom dynamikk i et virveldyr system, sebrafisk. Denne protokollen vil detalj en tilnærming som kan brukes for å oppnå dynamiske bilder av dele celler, som inkluderer: in vitro transkripsjon, sebrafisk avl / oppsamling, embryo embedding, og time-lapse imaging. Optimalisering og modifications av denne protokollen er også utforsket. Bruke H2A.F / Z-EGFP (etiketter kromatin) og mCherry-CAAX (etiketter cellemembranen) mRNA-injiserte embryoer, mitose i AB villtype, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant sebrafisk er visualisert. Høy oppløsning levende avbildning i sebrafisk gjør det interessant å observere flere mitoser til statistisk tallfeste mitotiske feil og timing av mitotisk progresjon. I tillegg er observasjon av kvalitative aspekter som definerer feil mitotiske prosesser (dvs. congression defekter, missegregation av kromosomer, etc.) og utilbørlig kromosom utfall (dvs. Aneuploidy, polyploidi, mikrokjerner, etc.) observert. Denne analysen kan brukes til observasjon av vev differensiering / utvikling, og er mottagelig for anvendelse av mutant sebrafisk og farmakologiske midler. Visualisering av hvordan defekter i mitose føre til kreft og utviklingsforstyrrelser vil sterktøke forståelsen av patogenesen av sykdommen.
Introduction
Mitose er en viktig cellulær prosess essensielt for vekst, differensiering og regenerering i en levende organisme. Ved nøyaktig fremstilling og replikasjon av DNA i inter, blir celle primet å dele seg. Den første fasen av mitose, profase, blir initiert ved aktivering av cyclin B / Cdk1. Prophase er kjennetegnet ved kondensering av kromatin materiale inn i kromosomer. Nuclear konvolutt sammenbrudd finner sted ved overgangen mellom prophase og prometafase. I prometafase, centrosomes, det kjerne senter for spindel formasjon, begynner å migrere til motsatte poler mens utvide mikrotubuli på jakt etter kinetochore vedlegg. Ved vedlegg, til konverteringer slutt på microtubule vedlegg og strekkrefter orientere kromosomer danner en metafase plate 1. Dersom alle kromosomene er riktig tilkoblet, er spindelenheten sjekkpunkt fornøyd, cohesin ringer holder søsterkromatider sammen spaltes, og mikrotubuli forkorte å trekke søsterkromatider til motsatte poler løpet anaphase 2,3. Den siste fasen, telophase innebærer forlengelse av cellen og reformasjon av den kjernefysiske konvolutten rundt de to nye kjerner. Cytokinese fulldelingsprosessen ved å skille cytoplasmaet av de to nye datterceller 4-6. Endring av viktige mitotiske baner (dvs. spindelenheten sjekkpunkt, sentrosomen duplisering, søsterkromatidutveksling samhold, osv.) Kan resultere i meta arrest, missegregation av kromosomer, og genomisk ustabilitet 7-10. I siste instans kan defekter i trasé kontrollere mitose forårsake utviklingsforstyrrelser og kreft, som nødvendig visualisering av mitose og dets defekter i en live, virveldyr, multi-cellular organisme 10-16.
Sebrafisk embryo tjene som en stor modellorganisme for live bildebehandling på grunn av gjennomsiktig vev, enkel mikroinjeksjon, og rask utvikling. Ved hjelp av sebrafisk, den overordnede målet med dette manuskriptet er åbeskriver en fremgangsmåte for direkte 5D (dimensjoner X, Y, Z, tid, og bølgelengde) avbildning av mitose 17 (figur 1C). Bruken av mutant sebrafisk defekt i ulike mitotiske trasé viser konsekvensen av slike feil. For denne protokollen, ble Aurora B Esco2 mutanter valgt å illustrere disse feilene. Aurora B er en kinase som er en del av kromosomet passasjer kompleks (CPC) som er involvert i spindeldannelse og mikrotubuli-vedlegg. Det er også nødvendig for spalting fure formasjonen i cytokinese 18,19. I sebrafisk, fører Aurora B-mangel av feil i fure induksjon, cytokinese, og kromosom segregering 20. Esco2, på den annen side, er en acetyltransferase som er avgjørende for søsterkromatidutveksling samhold 21,22. Det acetylates cohesin på SMC3 delen av ringen dermed stabiliserende cohesin å sikre riktig kromosom segregering ved metafase-anaphase overgang 23. Tap av Esco2 i sebrafisk fører til chromosome missegregation, for tidlig søsterkromatidutveksling separasjon, genomisk ustabilitet, og p53-avhengig og uavhengig apoptose 24,25. På grunn av tilgjengeligheten, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant sebrafisk (heretter referert til som aurB m / m og esco2 m / m, henholdsvis) vil bli brukt for å illustrere denne teknikken 25-27.
Kobling konfokalmikroskopi med fluorescerende-merket celle maskiner har aktivert forskere å visualisere kromatin og cellemembranen dynamikk under mitose 25,28,29. Fluorescerende-merket histoner har historisk blitt brukt til å visualisere kromatin. Histoner er kjerneproteiner sammensatt av fire forskjellige par (H2A, H2B, H3 og H4) som er ansvarlig for nucleosome struktur som komponerer kromosomer 30. Mens H2B er uten tvil den mest brukte histone for fluorescerende proteiner imus og cellekultur, bruk av Histone 2A, Familie Z (H2A.F / Z) har vist seg godt for bruk i sebrafisk 31,32. Concanavalin A og kasein kinase 1-gamma for eksempel, lokalisere til cellemembranen, og er tidligere vist seg effektive i å visualisere cellemembranen i kråkeboller og Drosophila 33,34. Andre studier har vist at CAAX fluorescerende-merket protein etiketter cellemembranen og var vellykket i sebrafisk 31. CAAX er et motiv som er anerkjent av posttranslasjonelle modifiserende enzymer som farnesyltransferases og geranylgeranyltransferases. Modifiseringer av disse enzymene forårsake proteinene blir membran-assosiert, således merking cellemembranen 35.
På grunn av den forutgående bruk i sebrafisk, valgte denne protokollen som skal brukes H2A.F / Z og CAAX å merke kromatin og cellemembranen. Anvendelse av denne fremgangsmåten vil tillate forskeren til å overvåke mitose på individuelt cellenivå for å observere individuelle kromosomdynamikk, samt samtidig overvåke flere celledelinger som kan påvirke vevet differensiering og utvikling. Denne artikkelen vil fokusere på å avbilde dynamikken i kromosom segregering under mitose på individnivå cellenivå. Innenfor dette manuskriptet, vil evnen til å observere flere mitotiske divisjoner, beregne divisjon tid, og tyde mitotiske fenotyper illustreres og drøftes. Ved hjelp av disse parametrene, fysiologisk relevante data kan samles og brukes til en rekke sykdomstilstander som påvirkes av mitotiske defekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruk av denne fremgangsmåten gjør det mulig å utlede atom konvolutt sammenbrudd, dannelsen av en metafase plate ved mikrotubul-kinetochore vedlegg, og segregering av søsterkromatider for å danne to nye celler in vivo og i en tidsavhengig måte. Evnen til å observere mitose i sebrafisk er fordelaktig i faste prøver og cellekultursystemer fordi cellene som avbildes i den naturlige fysiologi, er vevet gjennomsiktig som gjør det mulig for fluorescerende proteiner som skal brukes, utvikler de forholdsvis hur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
Referências
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd, ., J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O’Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
