VacuSIP, en forbedret Inex Metode for<em> In Situ</em> Måling av partikkel og oppløst Forbindelser Behandlet av Active Suspension Feeders

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Bunnhenge matere spille viktige roller i funksjon av marine økosystemer ^1. Ved å filtrere store mengder vann ^2,3, de fjerner og skille ut partikler (plankton og detritus) og oppløste forbindelser ¹ (og referanser deri), og er et viktig middel for bentisk-pelagisk kopling ^4,5 og næringsstoff sykling ^6,7. Nøyaktig måling av partikler og oppløste forbindelser fjernet og utskilles av bunn suspensjon brett (som svamper, sjøpung, børstemark og muslinger) er grunnleggende for å forstå deres fysiologi, metabolisme, og fôring økologi. Sammen med pumping hastighetsmålinger, gjør det også en tallfesting av nærings flukser mediert av disse organismene og deres økologiske innvirkning på vannkvaliteten så vel som på økosystemet skala prosesser.

Velge den riktige metoden for å måle fjerning og produksjonsrater av partikler og oppløst compounds av henge filter feeders er avgjørende for å skaffe pålitelige data om deres fôring aktivitet ^8. Som påpekt av Riisgård og andre, upassende metoder skjevhet resultater, forvrenge eksperimentelle forhold, produsere uriktige beregninger av inntak og utskillelse av visse stoffer, og kan føre til feilaktig tallfesting av nærings flukser behandles av disse organismene.

De to hyppigst benyttede metoder for å måle partikler og oppløste næringsstoffer flukser i filter feeders bære enten inkubasjon (indirekte teknikk) eller samtidig samling av ambient og pustet ut vann (direkte teknikker). Ruge teknikkene er basert på måling av hastigheten av endring i konsentrasjonen av partikler og oppløste næringsstoffer i inkubert vann, og å estimere forekomsten av produksjon eller fjerning sammenlignet med betryggende kontroll ^8. Men omslutter en organisme i en inkubasjon kammer kan endre sin feeding og pumping oppførsel på grunn av endringer i den naturlige strømningsregime, på grunn av en nedgang i oksygen og / eller i mat konsentrasjon, eller på grunn av opphopning av utskillelse forbindelser i inkubasjonen vann ^7,9 (og referanser deri). I tillegg til effekten av innesperring og modifiserte vanntilførsel, en større skjevhet av inkuberingsbetingelser teknikker som stammer fra re-filtreringseffekter (se for eksempel ^10). Selv om noen av disse metodiske problemer er blitt overvunnet ved hjelp av riktig volum og form av inkubasjonen beholderen ¹¹ eller med innføring av en resirkulerende klokkekrukke system in situ ¹² denne teknikk undervurderer ofte fjerning og produksjonsrater. Kvantifisering metabolismen av oppløste forbindelser, slik som oppløst organisk nitrogen (DON) og karbon (DOC) eller uorganiske næringsstoffer, har vist seg å være spesielt utsatt for skjevheter som følge av ruge teknikker ^13.

På slutten av 60-tallet og begynnelsen av 70-tallet, Henry Reiswig^9,14,15 pioner bruk av direkte teknikker for å kvantifisere partikkel fjerning av gigantiske Caribbean svamper med separat prøvetaking vannet innånding og pustes ut av organismene i situ. På grunn av vanskeligheter med å anvende Reiswig teknikk på mindre fjæring matere og i mer utfordrende forholdene under vann, ble mesteparten av forskningen på dette feltet begrenset til laboratoriet (in vitro) ansette meste indirekte ruge teknikker ^16. Yahel og kolleger ombygget Reiswig direkte in situ teknikken til å fungere i mindre skala forhold. Deres metode, betegnet Inex ^16, er basert på samtidig undervanns prøvetaking av vann inhalert (I) og utåndet (Ex) ved uforstyrret organismer. Den forskjellig konsentrasjon av en substans (for eksempel bakterier) mellom et par av prøver (Inex) gir et mål for bibeholdelsen (eller produksjon) av det stoff av dyret. Inex teknikk syssels åpent rør oger avhengig av excurrent stråle produsert av pumpe aktiviteten av den undersøkte organisme til passivt å erstatte det omgivende vannet i oppsamlingsrøret. Mens Yahel og kolleger har med hell brukt denne teknikken i studiet av over 15 forskjellige suspensjon matere taxa (f.eks ^17), er metoden begrenset av det høye nivået av praksis og erfaring som kreves, ved minuscule størrelsen på noen excurrent åpninger, og ved å sjøforhold.

For å overvinne disse hindringene, har vi utviklet en alternativ teknikk basert på kontrollert suge av samplet vann gjennom minute rør (utvendig diameter <1,6 mm). Vårt mål var å lage en enkel, pålitelig og rimelig enhet som ville tillate ren og kontrollert in situ vannprøver fra en svært bestemt punkt, for eksempel excurrent åpningen av bunnhenge matere. For å være effektive, har metoden for å være ikke-påtrengende for ikke å påvirke omgivelsene strømningsregime eller endre behavior av de undersøkte organismer. Enheten som presenteres her er betegnet VacuSIP. Det er en forenkling av den SIP-system utviklet av Yahel et al. (2007) ¹⁸ for ROV-basert point sampling i dyphavet. Den VacuSIP er vesentlig billigere enn den opprinnelige SIP og det er tilrettelagt for SCUBA basert arbeid. Systemet ble utviklet i henhold til prinsippene presentert og testet av Wright og Stephens (1978) ¹⁹ og Møhlenberg og Riisgård (1978) ²⁰ for laboratoriet.

Selv om VacuSIP system er designet for in situ studier av metabolisme av bunnopphengsbrett, kan den også brukes for laboratoriestudier og hvor det kreves en kontrollert og ren, punkt-kilde vannprøve. Systemet er spesielt nyttig når integrasjon over lengre perioder (min-timer) eller in situ filtre er påkrevd. Den VacuSIP har vært brukt med hell på Yahel lab siden 2011, og har ogsåvært ansatt i to nyere studier av nærings flukser mediert av Karibien og Middelhavet svamp arter ²¹ (Morganti et al. innsendt).

Bruk av bestemte samplere, langvarig prøvetaking varighet, og feltforhold, der VacuSIP er anvendt, innebære noen avvik fra standard oseanografiske protokoller for innsamling, filtrering, og lagring av prøver for sensitive analytter. For å redusere risikoen for forurensning av den VacuSIP systemet og fare for modifikasjon av den samplede vann ved bakteriell aktivitet etter samling, testet vi forskjellige in situ filtrering og lagringsprosedyrer. Forskjellige filtrering enheter, samling fartøyer, og lagring av fremgangsmåter ble undersøkt for å oppnå den mest egnede teknikk for analyse av oppløst uorganisk (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, _NH4 ^+, SiO ₄₎ og organisk (DOC + DON) forbindelser, og ultra-plankton (<1081; m) og partikkel organisk (POC + PON) prøvetaking. For ytterligere å redusere risikoen for forurensning, spesielt under feltforhold, ble antall håndteringstrinn reduseres til et minimum. Den visuelle format hvor fremgangsmåten er presentert er orientert for å lette reproduserbarhet, og for å redusere den tid som er nødvendig for effektivt å bruke teknikken.

Systemoversikt

For å prøve in situ pumpet vann fra suspensjons forer med exhalant åpninger så små som 2 mm, blir pumping aktivitet av hver prøve først visualisert ved å slippe ut filtrert fluorescein farget sjøvann ved siden av inhaleringsmiddel åpningen (e) og å observere dens strømning fra excurrent åpning ¹⁶ (se også figur 2B i ^18). Vannet inhalert og pustes ut av studien prøven (incurrent og excurrent) blir deretter samtidig samplet ved anvendelse av et par med liten rør installert på spesialbygde manipulatoren eller på to av de "arms "av en opp-ned fleksibel bærbart stativ (figur 1 og Supplerende Video 1). Vannet inhaleres av studien organismen blir samlet ved forsiktig å posisjonere den proksimale ende av et rør inne i eller i nærheten av inhaleringsmiddel åpning av studien organisme. En identisk røret blir så plassert på innsiden av excurrent åpningen. Denne operasjonen krever god forsiktighet for å unngå kontakt eller forstyrrelse av dyret, for eksempel ved sediment resuspensjon. til å begynne samplings, skjærer en dykker en skillevegg i oppsamlingskaret med en sprøyte nål festet til distale ende av hvert rør, slik at det ytre vanntrykk for å tvinge det samplede vann inn i beholderen gjennom prøvetakingsrøret. suge~~POS=TRUNC er initiert ved hjelp av vakuum tidligere opprettet i ampullene og av trykkforskjellen mellom det ytre vann og det evakuerte prøvebeholderen .

For å sikre en ren samling av utåndet vann og for å unngå utilsiktet suging av ambient vann ¹⁶ må vannet samplingsfrekvens holdes på et betydelig lavere hastighet (<10%) enn excurrent strømningshastighet. Sugehastigheten styres ved lengden av røret, og dens indre diameter (ID). Den lille indre diameter sikrer også en ubetydelig dødt volum (<200 mL per meter rør). Prøvetaking over lengre perioder (minutter til timer) gjør det mulig å integrere den iboende patchiness av de fleste stoffer av interesse. For å sikre at prøvene er tilstrekkelig bevart i lange undervanns prøvetakinger så vel som for transport til laboratoriet, en in situ filtrering anbefales for følsomme analytter. Valg av prøvetakingsbeholdere, filtrering montering og rør er diktert av studie organismer og den spesifikke problemstillingen. Protokollen er beskrevet nedenfor går ut på at en fullstendig metabolsk profil er av interesse (for en oversikt se figur 2). Men den modulære naturen til protokollen kan feller enkel modifisering for å imøtekomme enklere eller til og med svært forskjellige prøvetakingsordninger. For fullstendig metabolsk profil, bør prøvetakingsprotokollen omfatter følgende trinn: (1) Flow visualisering; (2) Prøvetaking ultra-plankton fôring (plankton <10 mm); (3) Prøvetaking uorganiske næringsstoffer opptak og utskillelse (ved hjelp av in-line filter); (4) Prøvetaking oppløst organisk opptak og utskillelse (ved bruk av in-line filter); (5) partikler mating og utskillelse (ved bruk av in-line filter); (6) Gjenta trinn 2 (ultra-plankton fôring som kvalitetssjekk); (7) Flow visualisering.

Når logistisk mulig, anbefales det at den metabolske profilmålinger kombineres med pumpehastigheten (for eksempel fargestoffet fremre hastighet metode, i ^16), så vel som med respirasjon målinger. Disse målingene er best tatt ved begynnelsen og slutten av prøvetagnings sesjon. For åndedrett måling, undervanns optodes eller mikroelektroder er å foretrekke.

Protocol

1. forberedende skritt og rengjøringsprosedyrer rensemiddel Bruke verneutstyr, laboratoriefrakk og hansker til alle tider. Utføre disse forberedende trinnene i en ren plass fri for støv og røyk. Forbered en saltløsning 5-10% syre (HCl) med frisk, høy kvalitet, dobbelt destillert vann. Forbered en 5% svært løselig enkel blanding av anioniske og ikke-ioniske overflateaktive løsning (Se Materials List) med frisk, høy kvalitet, dobbelt destillert vann…

Representative Results

Optimalisering av sjøvann innsamlingsmetoder Valg av solfangeren ampuller og rengjøringsmetoder VacuSIP-kompatible samle fartøy skal ha en skillevegg som gjør at prøvetaking for å bli initiert av piercing med en sprøyte nål. De bør tåle forhøyet undervannstrykket (2-3 barer på typiske scuba arbeidsdybde), og bø…

Discussion

forberedende skritt

Collector ampuller for DOM og næringsanalyse

Siden Samler fartøy kan interagere med oppløste mikrobestanddeler og sampler vegger kan være et substrat for bakterievekst ^30-34, forskjellige ampuller for DOM og nærings samling ble testet. Borosilikat er ikke anbefalt for silika kvantifisering ^33,35, siden glassflasker kan øke den opprinnelige konsentrasjonen av silika med opp …

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181