VacuSIP, 개선 INEX 방법에 대한<em> 현장에서</em> 미립자의 측정 및 용존 화합물은 액티브 서스펜션 피더에 의해 처리
Summary
We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.
Abstract
Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.
Introduction
저서 서스펜션 피더는 해양 생태계 (1)의 기능에 중요한 역할을한다. 물 2,3 대량 필터링함으로써, 그들은 제거하고 미립자 (플랑크톤과 암설) 및 (내부 및 참조) 용해 화합물 (1)을 배설 및 저서 – 원양 커플 링 4,5 영양 순환 6,7의 중요한 에이전트입니다. 정확하게 미립자 및 용해 화합물을 제거하고 (예 : 스폰지, 해초 강, 다모류 및 이매패 류 등) 저서 서스펜션 피더에 의해 배설을 측정하는 그들의 생리, 대사, 및 공급 생태를 이해하는 것이 필수적입니다. 함께 속도 측정을 펌핑하여, 또한 이러한 유기체 수질뿐 아니라 생태계 규모 과정에서 자신의 생태 영향에 의해 매개되는 영양소 플럭스의 정량화 할 수있다.
제거 및 생산 입자의 속도와 용해 닷컴을 측정하는 적절한 방법을 선택서스펜션 필터 피더에 의해 파운드는 먹이 활동 (8)에 관한 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 매우 중요하다. Riisgård 등 부적절한 방법 바이어스 결과가 지적한 바와 같이, 실험 조건을 왜곡 섭취와 특정 물질의 배설의 잘못된 추정을 생산,이 미생물에 의해 처리 된 영양 플럭스의 잘못된 정량화 될 수 있습니다.
두 가지 가장 자주 사용되는 방법은 배양 (간접 기술) 또는 주위의 동시 수집 및 호기 물 (직접 기술)를 포함하는 필터 피더의 입자 용해 영양 플럭스를 측정합니다. 배양 방법은 배양 물에 미립자의 농도로 용해 영양소의 변화율을 측정하고, 적절한 제어 8에 비해, 생산 제거 속도를 추정에 기초한다. 그러나, 배양 챔버에서 생물을 둘러싸는 자사의 feedin을 변경할 수 있습니다g 인해 및 / 또는 식품 농도, 또는 때문에 배설 배양 물 7,9의 화합물 (참고 문헌 내부)의 축적 산소의 감소로 인해 자연스러운 흐름 정권의 변화에 행동을 펌핑. 협착 및 변형 물 공급의 효과에 더하여, 배양 기술이 중요한 바이어스 재 여과 효과 (예 10 참조)로부터 유래한다. 이 방법론의 문제 중 일부가 배양 용기 (11)의 오른쪽 체적 형상을 사용하거나 반응계 12 재순환 벨자 시스템의 도입으로 극복되었지만,이 기술은 종종 분리 및 생산 속도를 과소. 이러한 용존 유기 질소 (DON)과 탄소 (DOC) 또는 무기 영양소로 용해 화합물의 신진 대사를 정량화, 배양 기술 (13)에 의해 발생하는 편견에 특히 발생하기 쉬운 것으로 입증되었습니다.
60 년대 후반과 70 년대 초반, 헨리 Reiswig에서9,14,15 별도로 현장에서 미생물에 의해 흡입과 호기 물을 샘플링하여, 거대한 카리브해 스폰지에 의해 입자 제거를 정량화하기 위해 직접 기술의 응용 프로그램을 개척했다. 작은 현탁액 공급기에보다 어려운 조건 중 Reiswig의 기술을 적용하는 어려움으로 인해,이 분야에 대한 연구의 대부분은 주로 간접 배양 기법을 이용한 16 (시험 관내) 실험실로 제한 하였다. 야헬와 동료들은 작은 규모의 환경에서 작업 할 현장 기술에 Reiswig의 직접적인을 튼튼. 그들의 방법은 INEX (16)라고, 방해받지 생물에 의해 (예) (에서) 흡입과 호기 물을 동시에 수중 샘플링을 기반으로합니다. 샘플 쌍 (INEX) 사이의 물질 (예를 들면, 박테리아)의 다양한 농도는 동물에 의한 물질의 보존 (또는 제조)의 측정치를 제공한다. INEX 기술은 개방형 튜브를 고용하고수동적으로 수집 튜브로 주변의 물을 대체 연구 유기체의 펌핑 활동에 의해 생성 된 excurrent 제트에 의존한다. 야헬 및 동료가 성공적으로 15 개 이상의 서로 다른 서스펜션의 연구에이 기술을 적용하고 있지만 분류군을 피더 (예를 들어, 17), 메소드가 일부 excurrent 오리피스의 소문자 크기에 의해, 필요한 연습과 경험의 높은 수준에 의해 제한되고,로 바다의 조건.
이러한 장애를 극복하기 위해, 우리는 예약 튜브를 통해 상기 샘플링 된 물 흡입 조절 (외경 <1.6 mm)에 기초하여 대안적인 기술을 발전시켰다. 우리의 목표는 저서 서스펜션 피더의 excurrent 구멍으로 깨끗하고 아주 특정 지점에서 현장 물 샘플링 제어 허용 단순하고 안정적이며 저렴한 장치를 만드는 것이 었습니다. 효과적이기 위해서는, 상기 방법은 주위의 유동 체제 영향 또는 B를 수정하지 않도록 비 간섭이어야연구 된 생물의 ehavior. 여기에 제시된 장치 VacuSIP 불린다. 그것은 야헬 동부 등에 의해 개발 된 SIP 시스템의 단순화이다. 깊은 바다에서 ROV 기반 포인트 샘플링 (2007) 18. VacuSIP은 원래 SIP보다 훨씬 저렴하고는 스쿠버 기반 작업에 적용되고있다. 이 시스템은 실험실 설정에 대한 라이트와 스티븐스 (1978) 19 Møhlenberg 및 Riisgård (1978) (20)에 의해 제공되고 시험 원칙에 따라 설계되었습니다.
VacuSIP 시스템 저서 현탁액 공급기의 대사 반응계의 연구를 위해 설계되었지만, 또한 실험 연구에 이용 될 수 있고, 제어 깨끗 포인트 소스 물 샘플 목적지가 요구된다. 현장 filtrations 또는 장기간 (최소 시간)에 걸쳐 통합이 필요한 경우 시스템이 특히 유용합니다. VacuSIP 2011 년 이후 야헬 실험실에서 성공적으로 사용하고, 또한이되었습니다카리브해와 지중해 스폰지 종 (21)에 의해 매개 영양 플럭스의 두 최근 연구에 사용 된 (Morganti 등. 제출).
VacuSIP이 적용되는 특정 샘플러 장기간 샘플링 기간, 현장 조건의 사용은, 수집, 필터링하고 민감한 분석을위한 샘플을 저장하기위한 표준 프로토콜 해양 다소 차이를 수반한다. VacuSIP 시스템 또는 수집 후에 세균 활성에 의해 샘플링 물의 변형의 위험에 의한 오염의 위험을 줄이기 위해, 반응계 여과 및 저장 과정에서 각종 시험. 다른 여과 장치, 수집 용기 및 저장 절차 용존 무기 (PO 4 3-, NO X – NH 4 +, 그런가 4)의 분석에 가장 적합한 기술을 달성하기 위해 조사하고, 유기 (DOC + DON)를 화합물 및 초 플랑크톤 (<1081; m) 및 입자상 유기 (POC + PON) 샘플링. 또, 특히 현장 조건 하에서, 오염의 위험을 최소화하기 위해, 처리 공정 수를 최소한으로 감소시켰다. 상기 방법은 제시되는 영상 포맷은 재현성을 용이하고 효율적으로하는 기술을 적용하는데 필요한 시간을 단축하도록 배향된다.
시스템 개요
2mm 작게 exhalant 오리피스와 서스펜션 피더에서 현장 펌핑 물 샘플, 각 시편의 펌핑 활동은 첫째 옆에 흡입 구멍 (들)과 excurrent 개구 (16)로부터의 흐름을 관찰에 형광 염색 해수를 여과 해제하여 가시화 (18 2B 그림도 참조). 연구 표본 (된 유입 및 excurrent)에 의해 흡입과 호기 물은 동시에 맞춤형 조작에 설치된 분 튜브의 한 쌍의 사용으로 또는 "아칸소의 두에 샘플링거꾸로 유연한 휴대용 삼각대의 MS "(그림 1 및 보충 비디오 1). 연구 유기체에 의해 흡입 물은 조심스럽게 내부 또는 연구 유기체의 흡입 구멍 근처에 하나 관의 기단부의 위치에 의해 수집된다. 동일한를 튜브는 다음 excurrent 구멍 안쪽에 위치한다.이 작업은 퇴적물 재 부유하여 예를 들어, 연락처 또는 동물의 방해를 피하기 위해 잘 관리해야합니다. 샘플링을 시작하려면, 다이버가 부착 된 주사기 바늘로 수집 용기에 격벽을 관통 샘플링 튜브를 통해 용기에 샘플링 된 물을 강제로 외부 수압 있도록 각각의 튜브의 말단부. 흡입 나란히 바이알에서 생성 된 진공에 의해 외부의 물과 배기 샘플 컨테이너의 압력 차에 의해 개시 .
호기의 물을 깨끗한 수집을 보장하고 AMBI의 실수로 흡입을 방지하기 위해엔트 물 (16)은 물 샘플링 레이트는 excurrent 유량보다 현저하게 낮은 비율 (<10 %)로 유지 될 필요가있다. 흡입 속도는 상기 튜브의 길이와 내경 (ID)에 의해 제어된다. 작은 내경도 무시할 죽은 볼륨 (<튜브의 미터 당 200 μL)을 보장한다. 장기간 (시간 분)에 걸쳐 샘플링이 가능 관심의 대부분 물질의 고유 patchiness를 통합 할 수 있습니다. 샘플을 적절하게 실험실로 운송뿐만 아니라 장시간 수중 샘플링 세션에서 유지되는 것을 보장하기 위해 현장 여과에 민감한 분석하는 것이 좋습니다. 샘플링 용기, 여과 어셈블리 및 튜브의 선택은 연구 생물 및 특정 연구 문제에 의해 결정된다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 전체 신진 대사 프로필 (개요는 그림 2 참조) 관심이 있다고 가정합니다. 그러나, 프로토콜의 모듈 특성은 F 허용또는 쉽게 수정은 단순 또는 매우 다른 샘플링 방식을 수용한다. 전체 대사 프로파일 샘플링 프로토콜은 다음 단계를 포함한다 : (1) 유동 가시화하는 단계; (2) 샘플링 초 플랑크톤의 먹이 (플랑크톤 <10 μm의); (3) (인라인 필터를 사용하여) 무기 영양소의 흡수와 배설을 샘플링; (4) 샘플링 유기 흡수와 배설을 용해 (인라인 필터를 사용) (5) 미립자 공급 및 배설 (인라인 필터를 사용) (6) 2 단계를 반복합니다 (품질 검사 등 매우 플랑크톤 먹이); (7) 시각화 흐름.
논리적으로 가능한, 그 대사 프로파일 측정 속도 펌프와 결합되는 것이되는 경우 (예를 들면, 염료 프론트 속도에있어서, 16)뿐만 아니라, 호흡 측정과. 이러한 측정은 최고의 샘플링 세션의 시작과 끝에서 수행된다. 호흡 측정, 수중 optodes 또는 마이크로 전극이 바람직하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
준비 단계
DOM 및 영양 분석을 위해 수집 튜브
수집 용기 용해 마이크로 성분과 상호 작용할 수 있고, 샘플러 벽 성장 30-34, DOM 영양 컬렉션 상이한 바이알 테스트 한 세균에 대한 기판 일 수 있기 때문이다. 샘플 신속 (30) 냉동하지 않는 경우 유리 병은 최대 두 배 실리카의 초기 농도를 증가시킬 수 있기 때?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 현장에서 자신의 도움을 MANEL 리바 감사합니다. 우리는 우리의 연구 및 샘플링 권한 그들의 지원을위한 "파크 천연 델 Montgrì, 레 레스 메디아 나는 엘 Baix 테르"에 감사하고 있습니다. 수중 매니퓰레이터는 Ayelet Dadon-Pilosof에 의해 설계된 씨 Pilosof에 의해 제작 하였다. 이 작품은 스페인 정부 프로젝트 CSI-산호 [RC 및 MR에 허가 번호 CGL2013-43106-R]에 의해 TM에 "Ministerio 드 EDUCACION, Cultura y를 Deporte (MECD)"에서 FPU의 교제에 의해 지원되었다. 이 G. 야헬에 카탈로니아 정부 [허가 번호 2014SGR1029]와 ISF 부여 13분의 1,280 및 BSF 보조금 2,012,089에 의해 자금 해양 생지 화학의 기여와 글로벌 변화 연구 그룹입니다.
Materials
| GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
| Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
| Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10pk |
| Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
| Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
| Peek Tubing (250µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used |
| Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
| (TOC) EPA VIALS | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09) |
| HDPE VIALS | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
| Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
| Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
| Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
| Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42) |
| In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13mm of diameter |
| PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
| TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter, pore size 0.7µm |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13mm of diameter |
| Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13mm of diameter, pore size 0.2 µm |
| Contrad 2000 Solution | Decon Labs | E123FH | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
| Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25mm of diameter , pore size 0.2 µm |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100g |
| Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
| Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7mm x 30mm |
| Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2ml |
| Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55mm p/microtube 1.5 ml |
| Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500g |
| Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
| Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 |
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