المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em> في الموقع</em> التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em> انواع معينة ايليجانس</em
Summary
We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).
Abstract
Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.
Introduction
التيلومير يحمي نهايات الكروموسومات من الانصهار الشاذة والتدهور. يتكون التيلومير الثدييات يكرر G الغنية hexameric، TTAGGG، والمجمعات shelterin. تسلسل التيلومير تكرار الديدان الخيطية هي مماثلة لتلك التي من الثدييات (TTAGGC). معظم حقيقيات النوى الاستفادة تيلوميراز إضافة يكرر التيلومير إلى غاياتهم الكروموسومات. ومع ذلك، 10 – 15٪ من الخلايا السرطانية تستخدم التيلوميراز آلية مستقلة، والمعروفة باسم البديل تطويل التيلوميرات (ALT) 3. سابقا، وذكرت أن يكرر شريط الحامض النووي ومتواليات المرتبطة به، ويدعى تالت، وتضخمت في التيلوميرات من خطوط متحولة التيلوميراز التي نجت العقم حرجة 2.
وقد تم قياس طول التيلومير بواسطة PCR الكمي أو اللطخة الجنوبية، التي تنص على متوسط طول التيلومير من إجمالي 4،5،6،7. قراءة عدد من تكرار التيلومير في كامل البيانات تسلسل الجينوم هو أيضا مؤشرا من إجمالي محتويات التيلومير 8. على الرغم من الخطيئةغلي التيلومير طول تحليل (STELA) يمكن أن توفر طول التيلومير واحد، فإنه لا يمكن أن توفر معلومات المكانية التيلومير 9. في حين POT-1 :: mCherry البروتين مراسل يوفر المعلومات المكانية التيلومير في الجسم الحي، فإنه لا يمكن أن تمثل أطوال التيلومير المزدوج تقطعت بهم السبل، كما POT-1 هو التيلومير واحد حبلا البروتين 10 ملزمة.
بينما توفر طرق المذكورة أعلاه المعلومات المتوسط من تسلسل المتكررة، مضان في الموقع التهجين (FISH) يسمح لمراقبة كمية ونمط المكاني للتسلسل الفردية للاهتمام على نطاق والكروموسومات. بدلا من تنقية الحمض النووي، يتم إصلاح الأنسجة أو الخلايا للحفاظ على المعلومات المكانية المحلية في الأسماك. وهكذا، FISH هو أداة الكمية والنوعية على حد سواء لرصد تسلسل تكرار الفردية، مثل تكرار التيلومير.
يوفر هذا البروتوكول وسيلة فعالة للكشف في وقت واحد على حد سواء TELOمجرد وأخرى يكرر على أساس التحسينات من الأساليب المذكورة سابقا 11،12. C. ايليجانس اليرقات أو البالغين متعددة الخلايا مع خلايا متباينة للغاية. عدم تجانس الخلايا يعرقل على التحليل الكمي لعدد كبير من البقع التيلومير. لزيادة عدد الخلايا تحليلها والأجنة معزولة وانتشرت على الشرائح المغلفة متعدد الليزين للأسماك. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا البروتوكول أيضا أن تقترن المناعي.
كبرهان أن يعمل البروتوكول، وتبين لنا أنه من الممكن لمراقبة وتحديد اثنين من سلاسل متكررة مختلفة. تم إنشاء مسبار الحمض النووي ضد TALT1 مع بسيطة PCR دمج digoxigenin-dUTP. ثم تم تهجين هذه مسبار TALT1 ومضان المسمى التيلومير السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق في وقت واحد. وفي وقت لاحق، تم الكشف عن digoxigenin بالطرق المناعي الكنسي. نقدم هنا الصور التمثيلية حيث TALT1 colocalized مع التيلومير في TRT-1 </eم> الناجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
والميزة الرئيسية لبروتوكول لدينا هي بساطة الإجراء دون ضرر ملحوظ على التشكل من الهيكل الخلوي. تم الأمثل عدة خطوات لC. FISH ايليجانس في هذا البروتوكول. وتشمل الخطوات الحاسمة لFISH الناجح وضع العلامات من تحقيقات، تثبيت الأجنة والاختراق. يوفر Digoxigenin-dUTP طريقة وضع ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).
Materials
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2X SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10X PBS | For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01 % w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20X SSC | To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1 % tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Equipments | |||
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens. |
| Dry block / aluminum block | Labtech | LBH-T03 | Set temperature to 80℃ |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
Referências
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, 14 (2001).
