蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em>その場で</emPNAプローブのある>ハイブリダイゼーション（FISH）<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

テロメアは、異常な融合と分解か​​ら染色体末端を保護します。哺乳類テロメアは、Gリッチ六量繰り返し、TTAGGG、およびshelterin複合体で構成されています。線虫のテロメア反復配列は、哺乳動物（TTAGGC）のものと同様です。ほとんどの真核生物は、それらの染色体の末端にテロメアリピートを追加するには、テロメラーゼを利用します。しかし、10 -癌細胞の15％がテロメアの代替長くする^（ALT）3として知られているテロメラーゼ独立した機構を利用します。以前、我々はテロメアとTALTという名前のその関連配列は、重要な無菌性^2を生き延びテロメラーゼ変異系統のテロメアで増幅されたことを報告しました。

テロメア長は、定量的PCRにより、または合計テロメア^4,5,6,7-の平均長さを提供し、サザンブロットによって測定しました。全ゲノム配列データにテロメアリピートの回数を読むまた、全テロメア内容⁸の指標です。罪が、GLEテロメア長解析（STELA）は、それがテロメア⁹の空間的な情報を提供することができない、単一のテロメアの長さを提供することができます。 POT-1 :: mCherryをレポータータンパク質が生体内でテロメアの空間的な情報を提供していますがPOT-1は、タンパク質^10を結合一本鎖テロメアであるとして、それは、二本鎖テロメアの長さを表すことはできません。

上述の方法は、反復配列の平均の情報を提供するが、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、染色体規模量、対象の個々の配列の空間的なパターンを観察することができます。代わりにDNAの精製、組織または細胞は、FISHにおける天然の空間情報を保存するために固定されています。このように、FISHは、テロメアリピートなどの個々の反復配列の観察のための定量的および定性的な両方のツールです。

このプロトコルは、両方のteloの同時検出のための効率的な方法を提供します前述の方法^11,12からの改良に基づく単なるおよびその他の繰り返し。C.エレガンスの幼虫や成虫は非常に分化した細胞と多細胞生物です。細胞の不均一性は、テロメアスポットの多数の定量分析に妨げます。分析した細胞の数を最大にするために、胚を単離し、FISH用ポリリジン被覆スライド上に広げています。また、このプロトコルは、免疫蛍光法と組み合わせることができます。

プロトコルが動作していることの証明として、我々は、2つの異なる反復配列を観察し、定量化することが可能であることを示します。 TALT1に対するDNAプローブは、ジゴキシゲニンdUTPをを取り入れたシンプルなPCRで生成しました。このTALT1プローブおよび蛍光標識されたテロメアPNAプローブを同時にハイブリダイズさせました。その後、ジゴキシゲニンは、標準的な免疫蛍光法によって検出しました。ここではTALT1はTRT-1にテロメアと共局在代表画像を提示します</eメートル>生存者。

Protocol

PCRによりジゴキシゲニンdUTPで1標識プローブ以前に13を説明したようにジゴキシゲニンdUTPをを含む10×dNTPミックスでPCRラベリングを行います。 製造者の指示に従ってスピンカラム精製を用いてPCR産物を精製します。 プローブはより短い200bpのであれば、反応混合物からのスピンカラムクロマトグラフィーではなく、スピンカラム精製で無料ジゴキシゲニンdUTPをを?…

Representative Results

これは、以前にALTの生存者は、内部ローカライズ」ALTのテンプレート「テロメア維持2用（TALT）配列を複製することによって、低周波では、テロメラーゼ欠損変異体、TRT-1（ok410）から出てくることが報告されました。 PNAプローブを使用して、我々は解剖生殖腺（ 図2A）にテロメアを可視化することができました。かすかなテロメア信号は<e…

Discussion

私たちのプロトコルの主な利点は、細胞構造の形態に目立つダメージのない手続きの簡単さです。いくつかのステップは、C。のために最適化されましたこのプロトコルでFISH エレガンス 。成功FISHのための重要なステップは、プローブのラベリング、胚および浸透の固定を含みます。ジゴキシゲニンdUTPを標識方法は、PCRまたはニックトランスレーションにより使いやすい標識法?…

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502