We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).
Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.
Telomer skyddar kromosomändarna från avvikande fusion och nedbrytning. Däggdjur telomer består av G-rika hexamera upprepningar, TTAGGG och shelterin komplex. Telomeren upprepningssekvens av nematoden är liknande dem i däggdjur (TTAGGC). De flesta eukaryoter använder telomeras för att lägga till telomeren upprepar sina kromosomändarna. Men 10-15% av cancerceller utnyttjar telomeras oberoende mekanism, känd som alternativ Förlängning av Telomerer (ALT) 3. Tidigare rapporterade vi att telomeren upprepar och dess tillhörande sekvenser, namnges som tält, amplifierades i telomererna av telomeras muterade linjer som överlevde kritisk sterilitet 2.
Telomerlängd mättes genom kvantitativ PCR eller Southern blöt, vilket ger genomsnittliga längden av den totala telomerer 4,5,6,7. Läs räkning av telomer upprepa i hela genomet sekvenseringsdata är också en indikator på den totala telomeren innehåll 8. Även om SinGLE telomerlängd Analysis (STELA) skulle kunna ge längden på en enda telomer, kan det inte ge rumslig information om telomerer 9. Medan POT-1 :: mCherry reporterprotein ger den rumsliga information av telomerer in vivo, kan den inte representera längder av dubbelsträngade telomerer, som POT-1 är ett enkelsträngat telomer-bindande protein 10.
Medan ovannämnda metoder ger i genomsnitt information repetitiva sekvenser, fluorescens in situ hybridisering (FISH) gör det möjligt att observera mängden och rumsliga mönster av enskilda sekvenser av intresse på en kromosom skala. Istället för rening av DNA, är vävnader eller celler fast att bevara den naturliga geografisk information i fisk. Således är FISH en både kvantitativ och kvalitativ verktyg för observation av enskilda upprepade sekvenser, såsom telomeren upprepas.
Detta protokoll ger en effektiv metod för samtidig detektion av både telobara och andra upprepningar baserad på förbättringar från tidigare beskrivna metoder 11,12. C. elegans larver eller vuxna är flercellig organism med högt differentierade celler. Heterogenitet celler hindrar på kvantitativ analys av ett stort antal telomeren fläckar. För att maximera antalet celler som analyserats, embryon isoleras och sprids på polylysin-belagda objektglas för fisk. Dessutom kan detta protokoll också kombineras med immunofluorescens.
Som ett bevis på att protokollet fungerar, visar vi att det är möjligt att observera och kvantifiera två olika repetitiva sekvenser. DNA-sond mot TALT1 genererades med enkel PCR införliva digoxigenin-dUTP. Då denna TALT1 sond och fluorescensmärkt telomer PNA prob hybridiserades samtidigt. Därefter digoxigenin detekteras genom kanoniska immunofluorescens metoder. Vi presenterar här de representativa bilder där TALT1 samlokaliserades med telomeren i TRT-1 </em> överlevande.
Den största fördelen med våra protokoll är enkelheten i förfarandet utan märkbar skada på morfologin hos cellstrukturen. Flera steg optimerades för C. elegans FISH i detta protokoll. De kritiska steg för framgångsrik FISH inkluderar märkning av prober, fixering av embryon och penetration. Digoxigenin-dUTP märkningsmetod ger en enkel att använda märkningsmetod genom PCR eller nick-translation. Att märka lång målsekvens är nick-translation föredra. I detta fall bör sondema spjälkas med lämpl…
The authors have nothing to disclose.
Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).
PNA probe | PANAGENE | custom order | |
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
Hybridizaiton solution | 3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
Hybridizaiton wash solution | 2X SSC, 50% formamide | ||
Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
Methanol | Carlo Erba | ||
Acetone | Carlo Erba | ||
Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
10X PBS | For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
PBST | 1X PBS, 0.1% tween-20 | ||
Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01 % w/v solution before use |
M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
Antibody buffer | 1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
20X SSC | To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
2X SSCT | 2X SSC, 0.1 % tween-20 | ||
10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP | ||
PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
Nematode growth media | to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4. | ||
Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
Razor | Feather | blade No. 11 | |
Rnase A | Enzynomics | ||
BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
Equipments | |||
Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens. |
Dry block / aluminum block | Labtech | LBH-T03 | Set temperature to 80℃ |
Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |