A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
Generalist bestuivers zoals de-buff tailed stuntel bij, Bombus terrestris, stuiten zowel voedingsstoffen en giftige stoffen in de bloemen nectar die zij verzamelen van bloeiende planten. Slechts een paar studies hebben beschreven de smaak reacties van de bijen in de richting van giftige stoffen in voedsel, en deze experimenten hebben voornamelijk gebruik gemaakt van de proboscis extensie respons op ingetogen honingbijen. Hier wordt een nieuwe gedrags-test gepresenteerd voor het meten van het voederen reacties van vrij bewegende, individuele werknemer hommels om voedingsstoffen en toxines. Deze test meet de hoeveelheid oplossing ingenomen door elke hommel en identificeert hoe tastants in voedsel invloed op de microstructuur van het eetgedrag.
De oplossingen worden op een microcapillaire buis individuele hommels die eerder zijn uitgehongerd voor 2-4 uur. Het gedrag is vastgelegd op digitale video. De fijnstructuur van het voedingsgedrag wordt geanalyseerd door het continu maken van de positie van de ProboGCB (monddelen) uit video-opnamen met behulp van event logging software. De positie van de snuit wordt bepaald door drie verschillende gedragscategorieën: (1) snuit is verlengd en in contact met de oplossing, is (2) zuigorganen uitgebreid maar niet in contact met de oplossing en (3) zuigorganen wordt opgeborgen onder de kop. Verder is de snelheid van de snuit terugtrekken weg van de oplossing wordt geschat.
In de onderhavige bepalingsmethode het verbruikte volume, het aantal voederplaatsen periodes, de duur van de toevoer aanvallen en de snelheid van de snuit terugtrekken na het eerste contact wordt gebruikt om de phagostimulatory of afschrikkende werking van de geteste verbindingen te evalueren.
Deze nieuwe smaak test kunnen de onderzoekers om te meten hoe stoffen gevonden in nectar invloed op het eetgedrag van de bijen en zal ook nuttig zijn voor de bestuiving biologen, toxicologen en neuroethologists het bestuderen van de smaak van de hommel's systeem.
Plant-bestuiver interacties zijn complex. Bestuivers te bezoeken bloemen naar nectar en stuifmeel als voedsel te verkrijgen; op zijn beurt, bestuivers te vergemakkelijken seksuele voortplanting bij planten. Hoewel deze relatie is meestal mutualistic, bloemen nectar en stuifmeel bevatten soms toxines of andere plantaardige verbindingen 1-5 die kan bestuivers schaden. De ecologische motieven voor de aanwezigheid van dergelijke verbindingen in nectar en stuifmeel is niet duidelijk in alle instellingen. Een uitstekende vraag op dit gebied is hoe bestuivers zoals bijen kunnen detecteren en te voorkomen dat bloemen met nectar bevatten giftige stoffen.
De hommel soorten, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), is een generalist bestuiver dat de bloemen van vele plantensoorten met inbegrip van de productie van nectar dat toxines bevat 6 bezoekt. Hommels is aangetoond dat consumeren oplossingen met hoge concentraties toxinen in een 24 hr twee keuze assay 7 voorkomen. deze assayvan de voedselconsumptie beschreven door Tiedeken et al. 7 is gebleken dat de bijen bitter verbindingen kunnen detecteren in oplossingen. Echter, was deze test niet in staat om de smaak te onderscheiden van post-ingestive processen zoals malaise, die ook van invloed kunnen zijn voedingsgedrag in deze tijd interval 8-10.
Bijen hebben smaak sensilla op hun antennes, monddelen en tarsi om verbindingen 11-13 te detecteren. De proboscis extensie reflex (PER) experimenten betrekken beteugeling van individuele bijen in een harnas en vervolgens het stimuleren antennal sensilla van de bij de productie van het voederen reflex 14-17. Bijen kunnen worden tegengehouden in individuele harnassen en vervolgens gestimuleerd tot het voederen reflex produceren als een analyse van hun vermogen om verbindingen 18,19 proeven. Anderen hebben de PER test om de gevoeligheid van de antennes of monddelen om gifstoffen 9,20 studeren gewijzigd. Echter, bijen blootgesteld aan spanning tijdens benutten. Dit kan invloed hebben op hoeze reageren op verbindingen 21.
Hier wordt een nieuwe test beschreven om de gedragsmatige smaak reactie van vrij bewegende hommels aan sucrose en kinine, een alkaloïde dat eerder werd gemeld afschrikmiddel te beoordelen 9 en giftig 10 tot honingbijen (Apis mellifera) en hommels (Bombus terrestris) 7, 22. Hoewel kinine is niet gevonden in plantaardige nectar, wordt dit alkaloïde vaak gebruikt als een aversieve stimulus in gedrags-en fysiologische studies in bijen 7,9,12,13,22. De methode bestaat uit video-opname monddelen van de hommels bij een hoge resolutie tijdens de eerste slurf contact met de testoplossingen. Specifiek wordt de fijne structuur van de voedingsreactie onderzocht door continu maken van gedrag in een 2 minuten interval. De verbruikte volume wordt gemeten gedurende de voertijd en zo de hoeveelheid voedsel gegeten kunnen worden gecorreleerd met de microstructuur vanhet eetgedrag. Ook de snelheid van de snuit terugtrekken wordt gemeten als een indicator van een werkzame vermijden en derhalve vooraf ingestive detectie.
Met deze roman gedrags assay, wordt kinine getoond aan het voeden van de buff-tailed hommel af te schrikken. De verminderde slurf contacttijd en voeding bout frequentie met water of de sucrose oplossing doorspekt met kinine wordt hier uitgelegd als een weigering om te starten verder te voeden op non-of voedingsbestanddelen potentieel toxische oplossingen. Wanneer kinine wordt toegevoegd aan 1 M sucrose oplossing, hommels niet alleen vermindering van het volume van de oplossing die zij verbruiken, ze de slurf ook sneller terug te trekken, waardoor de contacttijd tussen de monddelen en de oplossing die een toxine verminderen. Samen vormen deze resultaten suggereren dat kinine wordt waargenomen door de smaak receptor cellen aan de monddelen van de hommel, zoals reeds eerder geïdentificeerd in de honingbij 9. Kinine is een toxine voor insecten die malaise-achtig gedrag induceert in de honingbij 10 en knock-down in de malariamug (Anopheles gambiae) 23. Deze test zou wel leiden tot de identification van enkele afschrikking en potentieel toxische stoffen die door de smaak receptor cellen worden waargenomen op de monddelen van de hommels.
Het is cruciaal voor de microcapillaire buis worden gevuld met een geschikte hoeveelheid testoplossing te duren gedurende de testfase. Het wordt aanbevolen dat ten minste ongeveer driekwart van de microcapillaire buis (bijv 70-80 pi) wordt gevuld. Toch moet erop worden gelet dat niet volledig de microcapillaire buis om het risico van morsen tijdens het proces van scannen verminderen vullen en bevestigen van de microcapillaire buis naar de experimentele apparatuur. Zorg moet ook rekening worden gehouden bij de presentatie van de 500 mM sucrose druppel op de stuntel bij, zodat de experimentator vermijdt lekt de druppel in de wachtbuis.
De 4 mm gat op het puntje van het bedrijf buis is groot genoeg voor een volwassen werknemer hommel op natuurlijke wijze uit te breiden haar slurf in de richting van de testoplossing. Het is echter mogelijk dathommels kan de oplossing met hun antennes proeven voordat een verlenging van hun proboscises. Dit kan invloed hebben op de kans op proboscis extensie zoals PER in hommels kan worden opgewekt door het stimuleren van hun antennes met een suikeroplossing 15. In feite is de antennes van Hymenoptera, zoals de sluipwesp (Trissolcus brochymenae) 24 of de honingbij 13 zijn uitgerust met smaak sensilla, waardoor ze suikers en toxines smaakt kinine. Bijgevolg kunnen de eerste antennaal contacten met oplossingen die sterk afschrikmiddel verbindingen zoals kinine verminderen ook de motivatie van een hommel om zijn slurf uit te breiden en dus van invloed op de experimentele slagingspercentage. Hoewel antennal contact met de testoplossing niet kan worden gecontroleerd, in het huidige onderzoek hebben we geen significant effect van antennal contact op proboscis uitbreiding in de richting van de test oplossing te vinden. Bij deze bepaling van meteen de microcapillaire buis na de pre-testfase wduivin antennes van de hommels "zijn nog steeds binnen de holding buis kan de kans verkleinen de hommels aan de testoplossing met hun antennes te proeven.
De belangrijkste beperking van deze test ontstaat wanneer het bijhouden van de slurf terugtrekken uit de buurt van de testoplossing na het eerste slurf contact met behulp van de motion tracking video software. De videobeelden geeft alleen 2D-beweging van de slurf, zodat de gegeven uitgang van de snelheidsmeting kan onder of over de geschatte. Maar met enkele wijzigingen, kan dit aspect van de assay verbeteren.
Deze test kan worden gebruikt om de natuurlijke afweer voederen oplossingen bevattende verschillende verbindingen waaronder natuurlijk voorkomende plantaardige secundaire metabolieten observeren. Het observeren van de directe voederen reacties met deze test geeft gedetailleerde informatie over hoe hommels detecteren deze verbindingen. Dit is voordelig ten opzichte van bestaande 'go-no go' methoden zoals PER 18,19 </sup> En meer dan twee-choice assays 7 omdat deze methode produceert verschillende behavioral respons maatregelen, waaronder voedselconsumptie tijdens een discrete voeden wedstrijd.
Meten meerdere parameters tegelijkertijd zorgt voor een betere beoordeling van de smaak van een verbinding. Bijvoorbeeld in onze test vermijden hommels consumptie van water of de sucrose oplossing doorspekt met kinine. Terugtrekken van de slurf kan worden veroorzaakt door een verandering in de respons van de suiker receptor cellen 12,13. Onze analyse toont aan dat hommels schuif de slurf sneller na contact met de sucrose plus kinine oplossing dan alleen water; dit zou kunnen suggereren dat kinine beïnvloedt een afzonderlijke reeks van neuronen in aanvulling op het remmen van suiker sensing neuronen 9,12,13,25.
Onze analyse laat de analyse van de temporele patroon van gedragsreacties tijdens het voeden. Een soortgelijk protocol, waar de consumptie de tijd en het aantal aanvallen wordt gemeten heeft alklaar om geïmplementeerd om het voederen reactie van Drosophila tot voedzame en niet-voedzame suikers 26 te evalueren. Wij voorspellen dat bijen betrouwbaarder respons op stimulerende voeden in onze assay dan bij andere werkwijzen zoals PER exposeren omdat de bijen zich vrij bewegen in de wachtbuis 21. Deze techniek zal een diepgaande analyse van de smaak drempels mogelijk maken voor nutriënten en giftige stoffen om de mechanismen te verlichten van het voeden in hommels en mogelijk andere bijensoorten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de Leverhulme Trust subsidie (RPG-2012-708) en een BBSRC subsidie (BB / M00709X / 1) tot GAW.
Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
ImageJ software version 1.48 | ImageJ |