A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.
מאביקים Generalist כמו הדבורה זנב חובב, בומבוס האדמה, נתקלים בשני חומרים מזינים ורעלים בצוף פרחי שהן גובות לצמחים פורחים. רק מעט מחקרים תארו את תגובות gustatory דבורים לעבר רעלנים במזון, וניסויים אלו משמשים בעיקר את התגובה הרחבה חוטם על דבורי דבש מאופקים. הנה, assay התנהגותיות חדש מוצג למדידת תגובות ההאכלה של-נע בחופשיות, דבורי Bumble עובד פרט מזינים ורעלים. assay זה מודד את כמות פתרון מעובד על ידי כל דבורה ומזהה כיצד tastants במזון להשפיע על מייקרו של התנהגות האכילה.
הפתרונים מוצגים צינור microcapillary לדבורים בומבוס נפרדים מורעב בעבר במשך 2-4 שעות. ההתנהגות היא נתפסה על וידאו דיגיטלי. המבנה העדין של התנהגות האכילה מנותח באופן רציף על ידי הבקיע את עמדת proboscis (איברי פה) מהקלטות וידאו באמצעות תוכנת רישום אירועים. עמדת החוטם מוגדרת על ידי שלוש קטגוריות התנהגותיות שונות: (1) חוטם מוארך במגע עם הפתרון, (2) חוטם מוארך אך לא במגע עם הפתרון ו- (3) החוטם הוא מאוחסן מתחת לראש. יתר על כן את המהירות של החוטם חוזר בה מן הפתרון היא גם מוערכת.
ב assay הנוכחי היקף הפתרון נצרך, מספר התקפי האכלה, משך התקפי האכילה לבין המהירות של הכחשת החוטם לאחר המגע הראשון משמש כדי להעריך את phagostimulatory או פעילות ההרתעה של התרכובות הנבדקות.
assay הטעם החדש זה יאפשר לחוקרים למדוד כיצד תרכובות בצוף להשפיע על התנהגות האכילה של דבורים וגם תהיינה שימושי ביולוגי אבקה, חוקרי רעלים ו neuroethologists לומדים את מערכת הטעם של הדבורה.
אינטראקציות הצמח-מאביק הם מורכבים. מאביקים לבקר פרחים להשיג צוף ואבקה כמזון; בתורו, מאביקים להקל רבייה מינית בצמחים. בעוד מערכת היחסים הזו היא בעיקר הדדיות, צוף פרחים ואבקה לפעמים מכילים רעלים או רכיבים אחרים בצמחים, 1-5 אשר יכול לפגוע מאביקים. הרציונל אקולוגי בנוכחות תרכובות כאמור צוף ואבקה לא ברור בכל ההגדרות. שאלה מצטיינת אחת בתחום זה היא איך מאביקים כגון דבורים יכולים לזהות ולהימנע פרחים עם רעלים המכילים צוף.
המין הדבורה, בומבוס האדמה (לינאוס, 1758), הוא מאביק generalist כי מבקר הפרחים של מיני צמחים רבים, כולל אלה צוף לייצר המכילים רעלים 6. דבורי Bumble הוכחו להימנע פתרונות רבים המכילים ריכוזים גבוהים של רעלים ב assay שני-בחירת 24 שעות 7. assay זהמזון צריכה שתארה Tiedeken et al. 7 עולה כי דבורים יכולות לזהות תרכובות מרירות בפתרונות. עם זאת, assay זה לא הצליח להבחין טעם מתהליכים שלאחר ingestive כגון חולים שיכולים גם להשפיע האכלת התנהגות לאורך זמן זה מרווח 8-10.
דבורים להחזיק sensilla התעורר אצלם על האנטנות שלהם, איברי הפה טרסי לזהות תרכובות 11-13. רפלקס רחבת החוטם (PER) ניסויים לערב הרחקת דבורים בודדות ברתמת ולאחר מכן גירוי sensilla המחושים של הדבורה כדי לייצר את ההאכלה רפלקס 14-17. יכולים להיות מרוסנים דבורים רתמות בודד ולאחר מכן מגורה לייצר רפלקס ההאכלה כמו assay יכל לטעום תרכובות 18,19. אחרים שינו את assay PER ללמוד את הרגישות של האנטנות או איברי פה לרעלים 9,20. עם זאת, דבורים חשופים ללחץ במהלך רתימה. זה יכול להשפיע על אופןהם מגיבים תרכובות 21.
הנה, assay חדש מתואר להעריך את תגובת טעם התנהגותיים של בחופשיות-נע דבורי Bumble כדי סוכרוז כינין, אלקלואיד כי דווח בעבר להיות מרתיע 9 ו -10 רעילים דבורי דבש (שהאפיס Apis) ודבורים בומבוס (Bombus terrestris) 7, 22. למרות כינין לא נמצא בצוף צמח, אלקלואיד זה משמש לעתים קרובות גירוי מרתיע במחקרים התנהגותיים ופיסיולוגיים בדבורים 7,9,12,13,22. השיטה כרוכה וידאו הקלטת איברי הפה של הדבורים בומבוס ברזולוציה רבה במהלך מגע החוטם הראשוני עם פתרונות הבדיקה. באופן ספציפי, את המבנה העדין של תגובת ההאכלה נבחן כשקלע ברציפות שנמשכת מזה מרווח 2 דקות. היקף פתרון נצרך נמדד בתקופת האכלה ולכן כמות המזון הנאכל יכול להיות מתואם עם מיקרו שלהתנהגות האכלה. גם את המהירות של ביטול החוטם נמדד, כאינדיקטור של הימנעות פעילה, ולכן זיהוי מראש ingestive.
עם assay התנהגותיים הרומן הזה, כינין מוצג להרתיע האכלה של הדבורה זנב-חובב. שעת קשר חוטם המופחתת ותדירות התקף האכלה עם מים או תמיסת סוכרוז מהולה כינין מתפרשת כאן כסירוב ליזום עוד הניזונים שאינם תזונתיים או רעילים פתרונות. כאשר כינין מתווסף 1 M תמיסת סוכרוז, דבורים Bumble לא רק להפחית את עוצמת הקול של פתרון שהם צורכים, הם גם לבטל חוטם מהר, ובכך להקטין קשר הזמן בין איברי הפה הפתרון המכיל רעלן. יחד, משתמע מתוצאות אלה כי כינין נתפסת על ידי תאי קולטן התעורר אצלם על איברי הפה של הדבורה, כפי שכבר בעבר שזוהו דבש דבורים 9. כינין הוא רעלן לחרקים שגורם התנהגות כמו-מועקה של דבש הדבורים 10 ו מציאה של יתוש המלריה (gambiae אנופלס) 23. assay זה גם יכול להוביל מגלים הזדהותיון של כמה הרתעה ואפשרות תרכובות רעילות הנתפסות על ידי תאי קולטן טעם על איברי הפה ב הדבורים בומבוס.
זה חיוני עבור צינור microcapillary להתמלא נפח מספיק של פתרון המבחן להימשך לאורך כל שלב הבדיקה. מומלץ שלפחות סביב שלושה רבעים של הצינור microcapillary (למשל 70-80 μl) מלא. עם זאת, יש להיזהר שלא למלא את צינור microcapillary לחלוטין כדי להפחית את הסיכון של דליפה במהלך התהליך של סריקת הצמדת צינור microcapillary למנגנון הניסיוני. טיפול צריך גם לקחת בעת הצגת 500 אגל סוכרוז מ"מ עד הדבורה, כך הנסיין נמנע דולף האגל לתוך צינור ההחזקה.
חור 4 המ"מ בקצה צינור ההחזקה הוא גדול מספיק עבור דבורה עובד מבוגרת להאריך החוטם שלה באופן טבעי לכיוון פתרון המבחן. עם זאת יתכן כידבורי Bumble יכולים לטעום את הפתרון עם האנטנות שלהם לפני ההארכה בחוטמיהם. הדבר עשוי להשפיע על ההסתברות הרחבה חוטם לפי יכול להיות שהושרו דבורים Bumble ידי גירוי האנטנות שלהם עם תמיסת סוכר 15. למעשה האנטנות של דבוראים כמו הצרעה הטפילה (Trissolcus brochymenae) 24 או את דבורת דבש 13 מצוידי הטעם sensilla, ומאפשרים להם לטעום סוכרים ורעלים כמו כינין. כתוצאה מכך, אנשי קשר מחושים ראשוניים עם תמיסות המכילים תרכובות מרתיעות מאוד כמו כינין יכול גם להפחית את המוטיבציה של דבורה להאריך החוטם שלה ולכן להשפיע על שיעור הצלחה הניסיון. למרות קשר מחושים עם פתרון המבחן לא יכול להיות נשלט, במחקר הנוכחי לא מצאנו השפעה מהותית של קשר מחושים על רחבת חוטם לעבר פתרון המבחן. ב assay זה, מיד בהקמת צינור microcapillary לאחר שלב טרום מבחן Wתרנגולת האנטנות של הדבורים בומבוס עדיין בתוך צינור ההחזקה יכולה להפחית את ההזדמנות עבור הדבורים בומבוס לטעום את פתרון המבחן עם האנטנות שלהם.
המגבלה העיקרית של assay זה מתעוררת כאשר מעקב אחר הכחשת החוטם הרחק פתרון המבחן אחרי מגע החוטם הראשון באמצעות תוכנת וידאו הצעת מעקב. צילום הווידאו מציג רק תנועת 2D של החוטם, כך הפלט הנתון של מהירות המדידה יכול להיות מתחת או מעל המשוער. אולם עם כמה שינויים, היבט זה של assay יכול להיות שיפור.
assay זה יכול לשמש כדי לצפות בתגובות האכלה טבעיות כלפי תמיסות המכילות תרכובות שונות כולל מטבוליטים טבעי מתחוללי צמח משני. התבוננות תגובות ההאכלה המיידיות עם assay זה נותן מידע מפורט אודות אופן דבורי Bumble לזהות תרכובות אלו. זה יש יתרון על פני הקיים "ללכת-לא ללכת" שיטות כמו PER 18,19 </sup> ושוב שני-בחירת מבחנים 7 מכיוון ששיטה זו מייצרת כמה צעדי תגובה התנהגותית כוללים צריכת מזון במהלך התקף האכלה בדיד.
מדידת מספר פרמטרים בו זמנית מאפשרת הערכה טובה יותר של הטעם של תרכובת. לדוגמה ב assay שלנו, דבורים Bumble להימנע מצריכת מים או תמיסת סוכרוז מהול כינין. הכחשה של החוטם יכולה להיגרם על ידי שינוי התגובות של תאי קולטן סוכר 12,13. assay שלנו מראה כי דבורי Bumble לחזור החוטם מהר לאחר פניית הפתרון סוכרוז בתוספת כינין ממים לבד; זה יכול להציע כינין המשפיע קבוצה נפרדת של נוירונים בנוסף עיכוב נוירונים חישת סוכר 9,12,13,25.
assay שלנו מאפשר ניתוח של דפוס הזמני של תגובות התנהגותיות שבהאכלה. פרוטוקול דומה שבו זמן הצריכה ומספר ההתקפים נמדדים יש אלמוכן יושם כדי להעריך את תגובת ההאכלה של תסיסנית לסוכרים תזונתיים והלא תזונתיים 26. אנו צופים כי דבורים יפגינו תשובה אמינה יותר להאכלת ממריצים assay שלנו מאשר שיטות אחרות כגון PER כי הדבורים חופשיים לנוע בצינור ההחזקה 21. טכניקה זו תאפשר ניתוח ממצה של ספי הטעם וחומרים מזינים ורעלים כדי להאיר את מנגנוני האכלה בדבורים בומבוס ומיני דבורה אחרים בפוטנציה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענק האמון Leverhulme (RPG-2012-708) ומענק BBSRC (BB / M00709X / 1) כדי Gaw.
Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
Male luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
ImageJ software version 1.48 | ImageJ |