En enkel metode for å etablere primær human placenta (villøse) og Deciduale organkulturer, er beskrevet. Villous og Deciduale orgel kulturer er uvurderlig verktøy for å studere patogenesen ved den menneskelige mor til foster grensesnitt. Infeksjon med fakultative intracellulære bakterien Listeria monocytogenes er demonstrert.
Morkaken viser en stor grad av arts anatomisk variasjon. For å best forstå biologi og patofysiologien av human placenta, er det viktig å utforme eksperimenter med humane celler og vev. En fordel med organkultur er vedlikehold av tre-dimensjonale (3D) strukturell organisasjon og ekstracellulær matriks. Målet med metoden som beskrives her er vellykket etablering av ex vivo menneskesvangerskaps vev orgel kulturer og deres sunn kultur vedlikehold for 72-96 timer. Protokollen beskriver umiddelbar behandling av forsknings samtykket, placenta og Deciduale prøver frisk fra operasjonssalen. Dette er rikelig prøver som ellers ville bli forkastet. Detaljerte instruksjoner om den sterile innsamling av disse prøvene, inkludert morfologiske detaljer om hvordan du velger riktig vev for å etablere 3D organkulturer, er gitt. Placenta villous og Deciduale vev er microdissected inn 2-3 mm 3 stykkerog plassert separat på matrise linjert Transwell filtre og dyrket i flere dager. Villøse og Deciduale orgel kulturer er godt egnet for studiet av menneskelig host-patogen interaksjoner. I forhold til andre modellorganismer, er disse humane kulturer er spesielt fordelaktig å undersøke mekanismen for infeksjon av patogener som demonstrerer varierende mønstre av vertsspesifisitet. Som et eksempel viser vi infeksjon av placenta og Deciduale organkulturer med klinisk relevante, fakultative intracellulære bakterier patogene Listeria monocytogenes.
Infeksjon og betennelse på maternal-føtal grensesnitt representerer en viktig kilde til sykelighet og dødelighet hos kvinner og barn. Å forstå hvordan patogener infisere disse vevene er kritisk for utvikling av nye strategier for å forebygge og behandle sykdommer slik som for tidlig fødsel og fosterdød. Men høye artsvariasjon av morens-føtal grensesnitt kompliserer eksperimentell undersøkelse. Videre mest mikrobielle patogener vise vertsspesifisitet, kan dermed mange dyremodeller ikke fullt rekapitulere menneskelige smittsomme sykdommer. Visse organismer (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholera, og mange andre) er strengt patogene i mennesker, mens andre, slik som Listeria monocytogenes, viser en mer middels nivå av vertsspesifisitet 1. Vertsspesifisitet er dokumentert i mange aspekter av patogenesen, inkludert kolonisering 2, formidling tre, immununndragelser 4 </sopp> og nærings oppkjøp fem. Således er det av største viktighet for å velge optimale vert modellsystemer.
Består av føtale celler og mors blod, er placenta et organ som raskt utvikler seg i løpet av svangerskapet 6. I enkleste form, er den menneskelige placenta konstruert av føtale "villous" trelignende strukturer badet i mors blod. Gass og næringsutveksling skjer på tvers spesialiserte foster cellelag kalles trophoblasts som linje overflaten av villous trær. Morens livmor slimhinnene, kalt endometrium i den ikke-gravid kvinne, forvandler strukturelt og funksjonelt inn i decidua å imøtekomme den fetoplacental enhet. Villous trær er forankret i livmoren ved extravillous trophoblasts (EVT) som vandrer fra forankring celle kolonner i decidua. Den maternal-føtal grensesnitt, består derfor av decidua og morkaken.
Orgelet kultur teknikken beskrevet herhar vært brukt for å undersøke hvor og hvordan klinisk relevante humane patogener, inkludert L. monocytogene s og Toxoplasma gondii, krysser placentabarrieren 2,7. Disse ex vivo orgel kulturer replikere in vivo vev arkitektur, og er uten tvil fysiologisk svært relevante modellsystemer for mennesker placentation. Andre kultur teknikker inkluderer orgel explants hele, orgel skiver, og vev eller stamcelle organoids innebygd i 3D-matrix. For detaljer om disse alternativene, henvises det til en omfattende Nyeste anmeldelse 8. Vær oppmerksom på at denne protokollen er for egen kultur decidua og placenta villi. For å studere interaksjonen mellom celler og placenta uterusslimhinneceller, kan et ko-kultur teknikk være foretrukket. Vi henviser interesserte leser til tidligere beskrevet villøse-decidual co-kultur teknikk, som brukes av forskere som studerer trophoblast-mediert decidual vaskulær remodelle 9-11.
Innavlede, transgene og knockout musestammer kan tjene i eksperimentelle systemer til robust teste mekanismer. Men til tross for generell bevaring av kjerne genetisk materiale, de funksjonelle genomer hos mus og mennesker viser signifikante forskjeller i regulatoriske elementer 23. Det er ikke overraskende, derfor, at lovende prekliniske studier i dyremodeller er noen ganger ikke rekapitulert hos mennesker. Morkaken viser svært høy artsmangfold, og dermed gjengi dyremodeller mindre enn ideell for studiet av menneskelig sykdom 24. Erkjennelsen av både betydelige forskjeller i mennesker og mus immunologi 25, og det uttales divergerende utviklingen i placenta anatomi, er det klokt å vurdere bruken av ex vivo organkulturer fra menneskelig svangerskaps vev for eksperimentell undersøkelse.
Beskrivelsene, fotografiske bilder, og instruksjonsvideo i denne protokollen instruere forskere påhvordan å etablere villøse og Deciduale organkulturer på ECM-belagt transwell vev kultur inserts. Fordeler med denne teknikken er den relative enkelhet av mikro-disseksjon og mekanisk støtte transwellsystemet, spesielt når sammenlignet med alternative metoder slik som 3D-matriser innebygde eller organ- skive kulturer. Suspensjon av orgelet kultur på membran støtte muliggjør næringsstoff utveksling på alle vev overflater og levedyktighet holdes for kortsiktig kultur (96 timer for villous kulturer, 72 timer for Deciduale kulturer) .Dette teknikken gjør det mulig for å studere menneskelig morkake biologi på vev nivå, unektelig mer biologisk relevant enn monolayer cellekultur modeller.
Den mest kritiske trinnet i denne protokollen er mikro-disseksjon av hensiktsmessige villous og Deciduale stykker for orgel kultur. Optimale vevstykker blir demonstrert fotografisk (figur 2A og figur 3A) for å hjelpe til forskere for hvemvisualisering av svangerskaps prøver er ny. Det er spesielt viktig å velge villous trærne med grener som ender i EVT kolonner, da disse cellene vil migrere inn i ECM og bidra til å forankre villi til membranen. For begge typer organkulturer er nyttig for å redusere forstyrrelser i vev under medie endringer ved pipettering i en forsiktig og rolig måte.
Denne teknikken presenterer bare minimale problemer. Noen ganger prøver viser forurensning. Forurensning er vanligvis bakteriell (tidvis poly-mikrobiell), og bare blir tydelig etter 1-2 dager i kultur. Når forurensning observeres, skal blekemiddel anvendes, kulturen kastes, og den vevskulturinkubator steriliseres for å hindre at en langvarig problem. Det er flere mulige måter forurensning kan oppstå: in utero infeksjon, under operasjonen, under prøven høst / behandling, eller under orgelkultur vedlikehold. Slakte og behandlingstrinn er den mest sannsynlige tidenog sted for forurensning å bli introdusert. Derfor er det viktig å redusere mengden av tid prøven blir manipulert under innsamling og mikro-disseksjon. Dette vil redusere prøven eksponert for den omgivende, ikke-sterilt miljø. Avhengig av laboratorieoppsett, kan dissekere mikroskop være plassert inne i sterilt vev kultur hette.
Den histopatologiske analyse av organkulturer etter infeksjon med medisinsk relevant patogen L. monocytogenes, er vist her som en mulig anvendelse av protokollen. Immunfluorescens lokalisering av både bakterier og vertsimmunceller etter smitte frambringer ny innsikt i den menneskelige verten svar på patogener. Deciduale orgel kulturer kan tjene som en komplementær ex vivo eksperiment teknikk for å undersøke data generert fra in vivo mus infeksjoner, inkludert spennende rapporter som viser feil i murine Deciduale makrofag forsvar funksjoner 26,27. I tillegg menneskelig orgen kulturer kan anvendes i blandet infeksjon strategier, for eksempel som en konkurrerende inokulum sammensatt av flere isogene stammer av L. monocytogenes. Konkurransedyktige infeksjon av organkulturer er en følsom måte å teste relevansen av virulensfaktorer i menneske vert. En begrensning ved denne fremgangsmåten er vevet levedyktighet, som er begrenset til kortvarig kultur (96 timer for villous kulturer, 72 timer for Deciduale kulturer). Dette er ideelt for infeksjon med hurtigvoksende mikrober som L. monocytogenes, men lengre kulturer kan være nødvendig for patogener som tar mer tid til å etablere og spres gjennom vev.
For å redusere den globale byrden av graviditet komplikasjoner, må forskning fokuserer på å forstå patofysiologien av den menneskelige maternal-føtal grensesnitt. Bakterier, sopp og virus patogener som krysser fra mor til foster årsaken ødeleggende komplikasjoner under svangerskap og fosterinfeksjon. Kontrollert in vivo infeksjon av laboratorie aniMals er vanligvis regnet som gullstandarden for å ta opp hvordan patogener koloniserer og transitt mellom organer 28. Fordi morkake anatomi varierer sterkt over pattedyrarter, er det av største betydning å innlemme menneskelig vev i forskningsstrategier. Menneske villous og Deciduale orgel kulturer er svært relevante modellsystemer for å undersøke verts patogen interaksjoner. For å studere dette viktige ennå dårlig forstått organ, kan forskerne dra nytte av den overflod av ellers forkastet human placenta og Deciduale prøver, bruker organ kultur strategier som er beskrevet her.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Cristina Faralla and David Lowe for helpful discussions. We acknowledge Mark Weinstein and San Francisco General Hospital Pathology Department for expert advice. This work was supported by National Institute of Health grants R01AI084928 and Burroughs Wellcome Fund 41259 to A.I.B; G.A.R. was supported by F32AI108195, Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research grant, and University of California Partnerships for Faculty Diversity President’s Post-doctoral Fellowship.
Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4in, 1×2 0.5mm, Slight Curve |
Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4in, Straight Fine, Sharp |
Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
50 mL conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
10X Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10X PBS |
DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1000X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 mL Ethanol and adding 34.3 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 mL ethanol and adding 40 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert – 30mm diameter, 0.4μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~300μL aliquotsin the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
Bench top centrifuge |