Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino
Summary
Qui si descrive il nostro protocollo dettagliato per la preparazione di colonie di api singola coorte – uno strumento utile per analizzare la fisiologia dei lavoratori di ruolo associati. Descriviamo anche protocolli dettagliati per il trattamento di lavoratori con ormone giovanile e ecdysone per valutare il coinvolgimento di questi ormoni nella regolazione del comportamento dei lavoratori e / o la fisiologia.
Abstract
Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.
Introduction
L'ape europea, Apis mellifera, è un insetto eusocial con una società altamente organizzata 1. Api operaie (casta lavoro) sono impegnati in varie attività per mantenere l'attività delle colonie, e questi compiti cambiano a seconda dell'età del lavoratore api dopo eclosion, che viene indicato come divisione relativa all'età del lavoro 2-4. Lavoratori giovani (<13 giorni) si prendono cura della nidiata nell'alveare secernendo pappa reale (api nutrici), mentre i lavoratori più anziani (> 15 giorni) raccolgono il nettare e il polline di fuori dell'alveare (raccoglitori) 2-4. La fisiologia dei lavoratori cambia in associazione con questo spostamento ruolo. Ad esempio, la funzione delle ghiandole ipofaringee (HPGs), accoppiato ghiandole esocrine situati nella testa, i cambiamenti in associazione con il passaggio da ruolo infermieristico a foraggiare 2,5. HPGs infermiera ape sintetizzano principalmente principali proteine pappa reale, che sono i principali componenti di latte api. D'altra parte, HPGs falciatrici principalmentesintetizzare enzimi carboidrati metabolizzare, come α-glucosidasi III, per elaborare nettare miele convertendo saccarosio in glucosio e fruttosio. I nostri studi precedenti hanno rivelato che l'espressione di mrjp2, che codifica per una proteina importante pappa reale, e Hbg3, che codifica α-glucosidasi III, i cambiamenti durante il turno ruolo di 6-9.
Per determinare se i cambiamenti fisiologici nei tessuti lavoratore, compresi i HPGs, è associato con lo spostamento ruolo o con l'età dei lavoratori, sarebbe utile per manipolare la composizione della popolazione di una colonia di api, ad esempio per preparare singolo coorte colonie in cui i lavoratori di quasi la stessa età di eseguire diversi compiti 10,11. Robinson et al. (1989) ha descritto un metodo per stabilire un singolo-coorte colonia 10. colonie singola coorte inizialmente comprendono una regina e vecchi operai 0-2 al giorno. Alcuni giorni dopo aver stabilito le colonie, i lavoratori di almost la stessa età assumere compiti diversi. Alcuni lavoratori svolgono compiti di cura, come nelle colonie tipiche, mentre altri lavoratori eseguire le attività di foraggiamento prima del solito e sono quindi chiamati raccoglitori precoci. Il confronto di espressione genica tra api nutrici e raccoglitori precoci potrebbero fornire informazioni utili sulla fisiologia di ruolo associata dei tessuti dei lavoratori 12-16. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di colonie singola coorte per l'analisi della fisiologia di ruolo e / o età-associate di HPGs 16. Abbiamo anche descrivere brevemente come esaminare l'espressione genica di mrjp2 e Hbg3 da reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa-quantitativa (RT-PCR) per valutare HPG fisiologia.
Oltre all'analisi della fisiologia dei lavoratori nelle colonie singola coorte, l'esame del sistema endocrino è importante per analizzare i meccanismi di regolazione di ruolo associata la fisiologia dei lavoratori. ormone giovanile (JH), che viene known come l'ormone 'status quo' in larve di insetti, accelera lo spostamento nel ruolo da infermieristico per l'alimentazione delle api operaie a 11. Inoltre, ecdysone, che è conosciuto come l'ormone della muta durante la metamorfosi, potrebbe essere coinvolto nel passaggio ruolo di geni che codificano per molecole di segnalazione ecdysone sono espressi nei corpi di funghi, un più alto centro del cervello operaio 17-19. Pertanto, abbiamo anche descritto il protocollo dettagliato utilizzato nel nostro studio precedente 16 per trattare i lavoratori con 20E, che è una forma attiva di ecdysone e metoprene, un analogo JH, per l'analisi degli effetti del sistema endocrino sulla HPG fisiologia (espressione mrjp2 e Hbg3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparazione delle colonie singola coorte
Qui abbiamo descritto il protocollo utilizzato nel nostro studio precedente 16 per preparare colonie singola coorte per l'analisi di HPG fisiologia associata con lo spostamento nel ruolo di api operaie. Api bottinatrici infermiere e precoci che soddisfacevano i criteri descritti nelle procedure di 1.6-1.7 e la figura 2 sono stati osservati nelle colonie singolo di coorte (Tabella 1). Le fotografie in <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas ‘Systems Molecular Ethology’ from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.
Materials
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
Referências
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