Hormonforstyrrende forbindelser (EDC) udgør en væsentlig risiko for vandmiljøet. Kommunale renseanlæg er vigtige bidragydere til den østrogene potens af overfladevand. Den metode forudsat i dette papir giver mulighed for en vurdering af effekten og egnethed spildevandsrensning processer med hensyn til EDC fjernelse.
Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.
Bekymringer vedrørende de negative virkninger af hormonforstyrrende forbindelser på dyrelivet reproduktiv sundhed har ført EU til at placere to østrogene stoffer (østradiol og ethinylestradiol) på en "overvågningsliste" under vandrammedirektivet (VRD). EDC omfatte en række forskellige kemiske klasser, herunder naturlige og syntetiske steroid østrogener, narkotika, pesticider og industrikemikalier og bestanddele af forbrugerprodukter med kendte skadelige virkninger på dyrelivet. Nogle af disse forbindelser kan potentielt påvirke menneskers sundhed 1.
Forskning har vist, at spildevand fra renseanlæg er østrogene at fiske 2 og som en konsekvens mange recipienter er også østrogene at fiske 3. Dette blev først demonstreret gennem nationale undersøgelser i Det Forenede Kongerige, der viste en øget vitellogenin koncentrationer (en kvindelig specifik æggeblomme protein forstadie 4) i blodet hos vilde mandlige fisk og en høj prevalens af intersex (udvikle æg og / eller kvindelige reproduktive kanaler i testiklerne af mandlige fisk) i normalt gonochoristic fiskearter 5,6.
Konventionel spildevandsbehandling er typisk en tre-trins proces, der består af en indledende screening efterfulgt af primær og sekundær behandling, som fjerner både opløst og suspenderet organisk materiale. Effekten af fjerne individuelle EDC er afhængig af de fysisk-kemiske egenskaber af stofferne og om effektiviteten af behandlingsprocessen anvendt. For mange EDC fjernelse via adsorption og biologisk nedbrydning kan være betydelig, men ufuldstændig. Tertiær behandling, såsom sand filtrering, kan være effektive til at øge EDC fjernelse 7 mens avanceret behandling ved hjælp af avanceret oxidation (f.eks ozon) eller aktivt kul kan være effektive til at opnå nær fuldstændig fjernelse 7.
Vurderingen af en ny teknologi til spildevandsrensning needs at fastlægge effekten af den foreslåede proces i EDC fjernelse. Et batteri af tests, herunder målrettet kemisk analyse sammen økotoksikologi test med in vivo og in vitro bioassays, giver omfattende data til dette formål. Selvom meget nyttige i reguleringsøjemed, kan målrettet kemiske analyser kun give oplysninger om forbindelser (og specifikke metabolitter) overvåges. Bioassays desuden tillade "afsløring" af negative virkninger af metabolitter og behandling-genereret spildevand transformation biprodukter, der ellers ville blive uopdaget 8,9. Dette papir beskriver anvendelsen af et batteri af kemiske og økotoksicitet laboratorieanalyser til at vurdere effektiviteten af en række avancerede og nye spildevandsrensning processer til fjernelse østrogene styrke rå og behandlet spildevand og recipienter.
Renseanlæg er den største rute for forurening af overfladevand med EDC. En evaluering af effekten af fjernelse af hormonforstyrrende aktivitet af konventionelle, avancerede eller nye behandlingsprocesser kræver brug af en række forskellige kemiske og biologiske assays. Kemisk analyse ved hjælp af ikke-målrettede og målrettet analyse giver kvalitative eller kvantitative data om effektiviteten af fjerne individuelle komponenter og giver derfor en vurdering, der skal foretages mod miljøkvalitetskrav eller forventet ingen effekt koncentrationer for de forbindelser eller blandinger af forbindelser analyseres.
Frembringelsen af omdannelsesprodukter som følge af ufuldstændig mineralisering af stoffer efter behandling og tilstedeværelsen af ukendte biologisk aktive bestanddele i spildevand begrænser nytten af kemiske test alene. En kombination af in vivo og in vitro bioassays i kombination med analytisk kemikerry screening giver en nyttig værktøjskasse at fastlægge effekten af EDC fjernelse ved nye spildevandsrensning processer. Disse test, når udført parallelt med de traditionelle vandkvalitetsparametre og andre toksikologiske og mikrobiologiske endepunkter tillade en kritisk vurdering af nuværende og kommende spildevandsrensning teknologier.
Det er vigtigt at bemærke, at gær baseret østrogen skærme (f.eks YES) er ikke den eneste in vitro assays til bestemmelse østrogene styrke af kemikalier og spildevand. Et antal stabilt transficerede mammale cellebaserede assays er blevet udviklet for eksempelvis ER-CALUX 27 og hERa-HeLa-9903 28 med humane brystcancerceller eller cervikale tumorceller hhv. JA er blevet sammenlignet med lignende mammale cellebaserede assays og har vist sig at have et sammenligneligt højt reproducerbarhed, sand positive og sande negative østrogene identifikation satser 29, althoUH det undertiden anses for at være lidt mindre følsom 27. En fordel ved gær baseret reporter analyser er, at i laboratorier uden betydelig erfaring med pattedyr cellekultur kan lettere vedtaget YES, da det kræver mindre strenge bio-kontrolforanstaltninger og sterile teknikker (JA kan udføres på den øverste bænk hvis nødvendigt) . De menneskelige celle assays kræver også CO 2 inkubatorer og luminometre forhold til standard inkubator og mikropladelæsere anvendes i JA. To gær baseret østrogen reporter assays (JA, Saccharomyces cerevisiae og A-YES, Arxula adeninivorans) er i øjeblikket undergår mellem laboratorier stier til validering af ISO 19040 "Vand kvalitet – Bestemmelse af østrogene potentiale af vand og spildevand" fremhæve de industrier interesse i disse teknikker.
Der er en række begrænsninger af fremgangsmåderne beskrevet som omfatter den potentielle kontamineringaf prøver under prøveudtagning, prøve opbevaring og analyse med østrogene stoffer med oprindelse fra marken eller laboratorium miljøet eller af menneskelig forurening (f.eks blødgørere, overfladeaktive stoffer, produkter til personlig pleje). Denne type af forurening i YES-assayet (eller andre cellebaserede reporterassays) vil hæve baggrunden og påvirke brugen af assayet. Vandprøver eller opløsningsmidler, der er lagret i plastflasker kan let forårsage falske positiver. Falske negativer er også bekymring, da både LCMS / MS og YES assay kræver SPE at koncentrere østrogener til påviselige niveauer. Matricen, valg af SPE sorbent og elueringsopløsningsmiddel kan påvirke udvinding effektivitet og de typer af forbindelser elueres. Brug C18 SPE patroner til ekstraktion med de betingelser, der er beskrevet i denne protokol, kan generere en negativ bias, som meget polære og basiske forbindelser ville være dårligt tilbageholdt af sorbenten. Desuden er denne protokol kræver rekonstituering af det eluerede YES eluenten fra methanol til ethanol via inddampning til tørhed bidragyder nitrogen resulterer i tab af flygtige forbindelser. Som følge protokollen kan give en undervurderet østrogene aktivitet af analyserede prøver. Disse begrænsninger er især vigtigt, når man overvejer YES assay som ukendte eller uventede forbindelser kan blive savnet, fordi de ikke er blevet udvundet eller de er tabt på grund af fordampning. Desuden LCMS / MS teknik gør brug af mærkede interne standarder til at korrigere til nyttiggørelse; denne fremgangsmåde kan ikke bruges med YES-assayet.
Væsentlige begrænsninger af de vivo testning af spildevand omfatter høje omkostninger og tid, der kræves til vurdering sammenlignet med in vitro-metoder. I øjeblikket brugen af fisk embryo tests til at afsløre østrogene aktivitet er begrænset. Imidlertid har der været en vis succes med at producere østrogen lydhør transgene glødende fisk embryoner 30, som kan have fremtidige applikationer. Fathead minnows (anvendes i denne protocol) er et fælles laboratorium arter og VTG induktion i mandlig fisk er en veldokumenteret bio-markør for østrogene eksponering og en kvantificerbar måling af spildevand spildevand østrogenicitet 22 eller andre østrogene stoffer eller blandinger 31. OECD test retningslinjer for hormonforstyrrende kemikalier er blevet valideret ved hjælp af voksne elritse, japanske Medaka og zebrafisk 32,33, med VTG være en følsom biomarkør for østrogen eksponering i alle tre arter. Men VTG-induktion ikke direkte korrelerer til reproduktiv svækkelse og dermed de økologiske konsekvenser af spildevand eksponering, som det ses i alvorligt intersex skalle 3. På den anden side, skalle er ikke en klassisk 'laboratorium arter "for økotoksikologi forskning på grund af deres store størrelse, lang generationstid (2-3 år at nå seksuel modenhed), reproduktive stil; gruppe gydningen (avl) finder sted en gang om året, og det er vanskeligt at identificere mænd fra kvinder (andre end undergydeperioden). Dette har imidlertid normalt gonochoristic arter blevet meget godt undersøgt i Storbritannien, på grund af den opdagelse, at nedstrøms for østrogene spildevandsudledningerne, mandlige fisk udviste forstyrrelser til deres endokrinologi (fx tilstedeværelsen af kvinde-specifik vitellogenin i blodet) og histopatologi (ovotestes – udvikling æg i testiklerne og / eller kvindelige reproduktive kanaler) 5,6. Derfor, som en fremtidig anvendelse af disse protokoller, kunne skalle (eller lignende arter) være et nyttigt vilde sentinel arter at vise, om reelle forbedringer af spildevand kvalitet (og reduceret østrogenicitet) ses i floder, der modtager avancerede behandlede spildevand. De kan også anvendes i slutningen af rørsystemer til overvågning teknologisk forbedrede spildevand fra pilot skala planter 7. Når man overvejer hvilke arter til brug i in vivo spildevand vurderinger der er en afvejning mellem relativt hurtige og kontrollerede test ved hjælp laboratorium arter i forhold til denlængere felt baseret, men mere miljømæssigt relevant, test hjælp naturligt hjemmehørende arter. En sådan in vivo vurderinger er høje omkostninger og bør kun betragtes som det endelige sæt test følgende vurderinger ved kemisk analyse og in vitro assays.
Kritiske trin i de protokoller, der er beskrevet omfatter forberedelse og håndtering af prøver og glasvarer (dvs. flasker og prøvetagning udstyr skal forbehandles med egnede overfladeaktive rengøringsmiddel) for at undgå forurening af prøver fra miljøbelastende stoffer, herunder at begrænse kontakt af prøver med plast og andre materialer, der kan producere falske positiver. Dette er lige så vigtigt, når designe og bygge akvarier og fisk eksponering systemer. Ideelt akvarier (boliger aktier og under eksponeringer) skal bygges af materialer med lav adsorption 32 med minimal forurening risiko. Rustfrit stål kan bruges til spildevand eller vand spildevandstanke.Ud fra følgende betragtninger tanke af et glas konstruktion foretrækkes til akvarier (da dette giver også nem observation af fisk). Bør undgås Brugen af lav kvalitet plast rør eller slange 32, kan PVC 34 og ABS anvendes, hvis "korrekt krydret", dvs., til venstre for at udvaskes eventuelle forureninger i rindende fortynding vand i mindst 12 timer før brug. Medicinsk kvalitet silicium slanger har været ansat med succes i vores anlæg til peristaltisk pumpe levering af kemikalier og spildevand / fortynding vand til tanke. Samt overvejer østrogene forurening i konstruktion og drift af den Aquatics system, er det også vigtigt at tænke på kost af fisk; mange sømmelighed fisk fødevarer har vist sig at være østrogene for fisk. Derfor er det vigtigt at teste alle fødevarer for aktivitet (fx i gær Østrogen Screen, Se Beresford et al. 14), før du bruger dem i disse typer af undersøgelser.
Fejlfindingaf den kemiske analyse eller YES assay protokoller, der er beskrevet er forenklet, hvis kvalitetssikring prøver, herunder flere rejser, laboratorium og blanke opløsningsmidler analyseres sideløbende positive kontroller og reelle prøver at eliminere falsk positive og falsk negative resultater. Positiv (f.eks EE2) og negative bør også altid anvendes (fortynding kun vand) kontrol i in vivo assays til at bekræfte følsomheden af forventet biologisk biomarkør eller endepunkt (dvs. VTG eller histopatologi), og tillade nogen uventet forurening skal registreres ( fx fra forsøgsopstilling op, kost, eller fortynding farvande). Eventuelle ændringer i protokollen skal valideres forud for enhver undersøgelse.
Med strengere regulering af østrogene forbindelser ind i miljøet via Renseanlæg spildevand er det forestille sig, at mere effektive spildevandsrensning teknologier skal udvikles. Batteriet tests er beskrevet i dette manuskript komplimentereøkotoksikologiske og kemiske evaluering test normalt anvendes på renseanlæg udslip. Derfor, at fremtidige anvendelse af denne form for holistisk batteri af test bør gøre det muligt spildevand teknologiudviklere, og plante operatører, gennemføre de mest økologisk sikker designs overvejer de bedste metoder til at fjerne både specifikke regulerede østrogene kemikalier og overordnet biologisk aktivitet.
The authors have nothing to disclose.
Projects presented in this paper were funded by Severn Trent Water and Brunel University London. The authors would like to thank Alan Henshaw and John Churchley for providing field and laboratory assistance. T.J.C. thanks the Heinz Endowments for support. M.R.M. thanks the Steinbrenner Institute for a Steinbrenner Doctoral Fellowship and Carnegie Mellon University for a Presidential Fellowship.
Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
Incubator | Memmert | INB 400 | 37oC incubation required for carp assay |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Icemaker | Scotsman | AF80 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
Microfuge tubes, 0.5ml | Alpha labs | LW2372 | |
Microfuge tubes, 1.5ml | Alpha labs | LW2375 | |
Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Histology | |||
Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
Cover slips, 22x50mm | VWR | 631-0137 | |
Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast screen | |||
Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
Incubator | Memmert | INB 400 | |
Shaker | Grant | PSU-10i | |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Iron (III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
d-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
Copper (II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Chlorophenolred-b-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Steroids | |||
Acetone | Rathburn | ||
Acetonitrile | Rathburn | ||
Ammonia solution | Rathburn | ||
Ethylacetate | Rathburn | ||
Copper(II) nitrate. | Sigma-Aldrich | ||
Acetone | Rathburn | ||
Dichloromethane | Rathburn | ||
2, 4, 16, 16-d4-17b-estradiol | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-17a-ethynyl oestradiol. | CDN Isotopes | ||
17b-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
Estrone | Sigma-Aldrich | ||
17a-ethynyl oestradiol. | Sigma-Aldrich | ||
Hexane | Rathburn | ||
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fish study | |||
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | watson marlow | 982.0063.000 | |
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | watson marlow | 999.2008.000 | |
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15m | watson marlow | 913.A008.016 | |
200 series multi-channel persitaltic pump | watson marlow | 205CA | |
Silicone tubing x15m (dosing tanks) | vwr | SFM1-3250 | |
silicone tubing x 15m (large for inflow/outflow) | vwr | SFM1-5450 | |
2.5L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
magnetic stir bar 51x8mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | sigma aldrich | E10521-10G | |
17α-Ethynylestradiol | sigma aldrich | E4876-100MG | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SPE | |||
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk4 | sigma aldrich | 57276 | |
disposable liners for manifold | sigma aldrich | 57059 | |
filtration tubes without frits 6ml pk 30 | sigma aldrich | 57242 | |
reservior adaptors pk 12 | sigma aldrich | 57020-U | |
stainless steel weight for manifold pk 4 | sigma aldrich | 57278 | |
male luer plug for manifold pk12 | sigma aldrich | 504351 | |
SPE Vacuum Manifold | sigma aldrich | 57265 | |
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | waters | WAT054806 | |
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | waters | WAT020515 | |
Methanol HPLC grade 2.5L | fisher scientific | M/4056/17 | |
7ml glass vials with lids (58x17mm) pk 399 | fisher scientific | TUL-520-031K | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
vacuum pump e.g. VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |